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        應(yīng)用PCR-DGGE分析肉雞呼吸道中細(xì)菌多樣性

        2013-10-25 05:42:28山東寶來利來生物工程股份有限公司汪孟娟曹銀生胡艷霞王京京辛國(guó)芹徐海燕
        中國(guó)飼料 2013年4期
        關(guān)鍵詞:電泳條帶變性

        山東寶來利來生物工程股份有限公司 汪孟娟 曹銀生 胡艷霞 王京京 辛國(guó)芹 徐海燕

        動(dòng)物呼吸道疾病易造成動(dòng)物生長(zhǎng)減緩、料肉比增高、產(chǎn)蛋力降低、免疫力下降,更有甚者直接導(dǎo)致動(dòng)物死亡或者繼發(fā)其他疾病死亡,給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失。然而使用抗生素治療該病又會(huì)帶來一系列副作用,因此開發(fā)一種通過恢復(fù)和調(diào)整動(dòng)物呼吸道內(nèi)菌群平衡,達(dá)到預(yù)防和治療動(dòng)物呼吸道感染的微生態(tài)制劑十分必要。Sullivan等(2001)認(rèn)為,正常的微生物菌群可以起到防止?jié)撛诘闹虏∥⑸锝ㄈ杭胺乐辜航?jīng)存在的機(jī)會(huì)菌過度生長(zhǎng)的作用。由此看來,研究呼吸道正常菌群的演替次序和變化特征,是深入認(rèn)識(shí)炎癥本質(zhì)、開發(fā)呼吸道益生菌的理論依據(jù)。

        1993年Muzyer等首次將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究,并證實(shí)該技術(shù)在研究自然界微生物群落遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。本試驗(yàn)通過PCR-DGGE技術(shù)分析了肉雞呼吸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了鑒定,探討此方法在研究動(dòng)物呼吸道微生物多樣性的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品的采集與處理 分別取 10、20、30、40日齡的肉雞(采自泰安某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)),于超凈臺(tái)下分別取喉管和氣管,剪碎放入無菌離心管中。

        1.1.2 主要儀器 PCR儀、DGGE電泳儀(Bio-Rad)。

        1.2 總DNA的提取 向裝有喉管和氣管的離心管中,分別加入5 mL無菌生理鹽水,振蕩5 min,800 r/min離心10 min,取上清于無菌1.5 mL EP管中,12000 r/min,離心 2 min,倒掉上清。DNA提取采用Mobile公司的BIO-101 DNA extraction Kit試劑盒,步驟按說明書進(jìn)行。

        1.3 16 S rDNA V3片段的PCR擴(kuò)增 將提取的DNA直接作為PCR模板,采用對(duì)大多數(shù)細(xì)菌的16 S rRNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)(錢麗君,2007):341F(5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA- CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 534R(5’-ATTAC-CGCGGCTGCTGG-3’), 擴(kuò)增長(zhǎng)約 200 bp, 用于DGGE 分析。 PCR 反應(yīng)體系 (25 μL):2×Taq mix 12.5 μL,上下游引物(25 pmol/μL)各 1 μL,模板DNA 1 μL,無菌雙蒸水 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:采用降落 PCR,94℃預(yù)變性 4 min;94℃ 1 min,65℃45 s,退火溫度每個(gè)循環(huán)降低0.5℃,當(dāng)退火溫度降至55℃后,再以該溫度擴(kuò)增15個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

        1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE) DGGE變性梯度凝膠濃度為8%,變性梯度為30%~70%(7 mol/L尿素和40%甲酰胺為100%變性)。電泳時(shí),首先在220 V電壓下預(yù)電泳10 min,隨后在85 V的固定電壓下電泳16 h。電泳結(jié)束后,進(jìn)行硝酸銀染色(Bruck等,2003),用數(shù)碼相機(jī)對(duì)結(jié)果拍照,并采用 Quantity One軟件 (Bio-Rad)對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行聚類分析。

        1.5 DGGE圖譜中部分優(yōu)勢(shì)條帶的序列分析用無菌手術(shù)刀將DGGE圖譜中部分分離明顯、條帶清晰且亮度高的優(yōu)勢(shì)性條帶從凝膠上切下,加入40 μL去離子無菌水,將膠塊搗碎,4℃過夜。取液體做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為去掉“GC夾”的 341 F和 534 R,PCR體系和條件同上(Devillard等,2005)。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 16S rDNA片段的擴(kuò)增 16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1。由圖1可見,通用引物341 F及534 R對(duì)各樣品細(xì)菌16 S rRNA基因均得到較好擴(kuò)增。

        2.2 DGGE指紋圖譜及圖譜分析結(jié)果 各樣品DGGE指紋圖譜見圖2。由圖2可見,不同部位比較,肉雞的喉和氣管中細(xì)菌的DGGE圖譜的條帶數(shù)、條帶位置和亮度存在一定程度的差異,但總體來說,雖然樣品條帶數(shù)較多,但優(yōu)勢(shì)條帶變化不大,條帶A、B、C、D、E和F在整個(gè)養(yǎng)殖周期的喉和氣管中一直保持優(yōu)勢(shì)地位,經(jīng)鑒定分別為:Citrobacter sp.,Pseudomonas aeruqinosa,Pasteurellaceae bacterium,Uncultured bacterium,Gallibacterium anatis,Uncultured Enterobacteriaceae bacterium。G條帶只在肉雞養(yǎng)殖后期的喉中占優(yōu)勢(shì),鑒定為:Mycoplasma qallisepticum。

        相同部位不同日齡樣品比較,養(yǎng)殖中、后期喉的樣品條帶數(shù)明顯多于養(yǎng)殖前期,其中條帶H和I在養(yǎng)殖中期出現(xiàn)后,便一直存在于整個(gè)養(yǎng)殖過程,并保持一定的亮度,經(jīng)鑒定為Klebsiella pneumoniae和 Uncultured bacterium,條帶 J雖然在養(yǎng)殖前期的喉管樣品中已被檢測(cè)到,但亮度較暗,在養(yǎng)殖中期的樣品中開始變亮,經(jīng)鑒定為Klebsiella pneumoniae;對(duì)于氣管樣品來說,30日齡左右肉雞的氣管樣品條帶數(shù)明顯多于其他時(shí)期。

        UPGMA相似性聚類結(jié)果表明,養(yǎng)殖前期樣品喉中的條帶與養(yǎng)殖中后期相似度較低,只有55%;養(yǎng)殖中、后期不同部位,同一時(shí)期的樣品相似度均達(dá)到了75%,說明在整個(gè)養(yǎng)殖過程中,肉雞呼吸道中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)是在發(fā)生變化的。

        3 討論

        DGGE技術(shù)主要是利用梯度變性膠來分離DNA片段,理論上認(rèn)為,只要選擇的電泳條件,如變性劑梯度、電泳時(shí)間、電壓等足夠精細(xì),有一個(gè)堿基差異的DNA片段均可被分開。DGGE具有傳統(tǒng)微生物分析方法無可比擬的優(yōu)勢(shì),在科學(xué)研究中廣泛應(yīng)用(Ferguson,2007)。

        在本研究中,16S rDNA V3區(qū)的PCR-DGGE圖譜能夠很好地對(duì)肉雞呼吸道中的細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分,雖然數(shù)據(jù)不能代表所有肉雞呼吸道內(nèi)細(xì)菌群落的情況,但可以說明PCR-DGGE技術(shù)能夠有效地用于呼吸道菌群的分析。其DGGE圖譜可以反映菌群的組成情況,同時(shí)結(jié)合圖譜中條帶的序列分析,還可以了解具體的優(yōu)勢(shì)菌群的種類。

        在畜禽養(yǎng)殖中,應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)可建立一種不依賴傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)而能原位揭示畜禽體內(nèi)細(xì)菌種群組成的分子診斷技術(shù)和病原菌分子診斷技術(shù)。通過檢測(cè)畜禽呼吸道正常微生物區(qū)系組成,建立基于機(jī)體內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的健康畜禽動(dòng)物評(píng)價(jià)技術(shù),還可檢測(cè)畜禽動(dòng)物呼吸道微生物的動(dòng)態(tài)變化和病害后微生物區(qū)系組成的差異,以及使用微生態(tài)制劑前后微生物區(qū)系組成的差異。通過對(duì)畜禽呼吸道內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的揭示,為新的畜禽微生物制劑菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供候選菌株和理論基礎(chǔ)。

        [1]錢麗君,張德民,徐小紅.應(yīng)用DGGE分析三疣梭子蟹養(yǎng)殖塘底泥細(xì)菌的多樣性[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007,31(2):204 ~ 209.

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