中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 吳 超 程林麗 張素霞 董曉云

北京市順義區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 李林霞

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀Waters 2996-Photodiode Array Detector（Waters 2695 Separations Module）；配熒光檢測器；渦動儀（北京北德科學(xué)器材有限公司）；2K15通用臺式冷凍離心機(jī)（美國 Sigma公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （瑞士BUCHI公司）；天平（感量 0.01 g，德國 Accula 公司）；分析天平（感量 0.0001 g，德國 Sartorius公司）；水平搖床；移液器；一次性注射器；0.45 μm有機(jī)濾膜。

1.2 藥品和試劑 除特殊注明外，本法所用試劑均為分析純，水符合GB/T 6682中一級水的規(guī)定。喹酸標(biāo)準(zhǔn)品 （純度 ≥99.7%，購于Sigma公司）；甲醇、乙腈均為色譜純（購于Sigma公司）；氫氧化鈉；無水硫酸鈉；乙酸乙酯；正己烷；磷酸。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Intel ODS-3 C18柱，50 mm×4.6 mm（i.d.），粒徑 5 μm；柱溫：室溫；流動相：0.02 mol/L磷酸溶液－乙腈－四氫呋喃（69∶16∶15，V∶V∶V）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；激發(fā)波長：325 nm；發(fā)射波長：369 nm。

1.5 樣品前處理 稱取配合飼料2 g（或濃縮飼料、預(yù)混合飼料1 g，精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加無水硫酸鈉2 g，加乙酸乙酯10 mL，300 r/min振蕩30 min。經(jīng)8000 r/min離心10 min后，取上清液至雞心瓶。殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。50℃旋蒸至干，加入0.02 mol/L磷酸溶液0.8 mL，渦動10 s，再加入正已烷1.6 mL，渦動1 min。將混合液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，于3000 r/min離心10 min，取下層清液并用0.02 mol/L磷酸溶液定容至1.0 mL，過0.45 μm有機(jī)濾膜后供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用流動相稀釋呵惡喹酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液， 配制成濃度為 10、20、50、100、300、500 ng/mL的系列工作液，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，喹酸峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。喹酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=53.83x-139.6，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.2 方法的靈敏度 取10個空白樣品按1.5中的方法處理后進(jìn)行HPLC檢測。測得基線噪音值，并求其平均值。按信噪比S/N=3為檢測限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ），結(jié)果見表1。由表1可見，雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預(yù)混合飼料中喹酸檢測限為 2.02～5.93 μg/kg，定量限為 6.72～19.74 μg/kg。因此，確定方法的檢測限為 6.0 μg/kg，定量限為 20.0 μg/kg。

2.3 檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度 對雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預(yù)混飼料分別進(jìn)行20、200、2000 μg/kg的藥物空白添加回收實(shí)驗(yàn)，按1.5中的方法處理后進(jìn)行HPLC檢測。每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3 d，計算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結(jié)果見表2。由表2可見，在三個濃度添加水平下，各類飼料中喹酸的平均回收率為85.75%～96.77%，均滿足70%～120%；日內(nèi)變異系數(shù)為2.24%～9.63%，均小于15%，日間變異系數(shù)為2.35%～8.35%，均小于15%，方法回收率高，精密度好。各類飼料的相關(guān)色譜圖見圖2至圖8。由圖可見，在雞配合飼料、雞濃縮飼料、雞預(yù)混飼料中喹酸保留時間處無雜峰干擾。

表1 飼料中喹酸檢測的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

表1 飼料中喹酸檢測的LOD和LOQ（n=10） μg/kg

飼料種類 LOD LOQ雞配合飼料 4.60 15.32雞濃縮飼料 4.14 13.80雞預(yù)混合飼料 2.02 6.72

表2 飼料中喹酸添加回收率及變異系數(shù)

表2 飼料中喹酸添加回收率及變異系數(shù)

樣品 添加濃度/（μg/kg）平均回收率/% 日內(nèi)變異系數(shù)（n=5，%）日間變異系數(shù)（n=15，%）雞配合飼料20 93.16 6.46 6.82200 92.43 5.28 6.752000 94.62 7.75 8.1710000 87.33 5.29 6.31雞濃縮飼料20 92.73 6.82 7.14400 92.96 7.10 7.284000 94.55 5.79 6.22100000 85.75 2.24 2.35預(yù)混合飼料20 96.77 4.86 5.62200 90.56 9.63 8.3510000 94.64 7.39 7.74100000 88.95 5.06 5.18雞

3 討論

3.1 儀器條件的建立 劉艷萍等（2009）用0.01 mol/L 草酸-乙腈（65∶35，V∶V）分析了鰻魚中的喹酸。李耀平等（2004）采用乙腈-水（用冰乙酸調(diào)pH3.0，60∶40，V∶V∶V） 分析了出口歐鰻中的喹酸。仲鋒等（2002）以及農(nóng)業(yè)部236號公告中均采用0.02 moL/L磷酸溶液-乙腈-四氫呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）分離檢測了魚肉組織或動物樣品組織中的喹酸和氟甲喹。錢疆等（2002）年用甲醇-乙腈-5 mmol磷酸二氫鈉 （用20%磷酸調(diào)pH=3）分析出口水產(chǎn)品中的喹酸。通過對上述文獻(xiàn)報道的儀器分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些流動相條件均能滿足喹酸的檢測需要，但采用0.02 mol/L 磷酸溶液-乙腈-四氫呋喃 （69∶16∶15，V∶V∶V）流動相分析時喹酸峰形最佳，出峰時間最合適，因此采用該流動相組成。

3.2 樣品前處理 在樣品的提取凈化中，分別采用乙酸乙酯、磷酸鹽緩沖液、乙腈試劑進(jìn)行研究，結(jié)果表明，乙酯乙酯提取的藥物回收率在95%以上且共提取物較少；磷酸鹽緩沖液提取，共提取雜質(zhì)多且去蛋白不徹底；乙腈提取共提取物雖少，但回收率僅70%左右。因此選擇乙酸乙酯作為樣品提取液。用乙酯乙酯提取飼料中的喹酸后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和磷酸緩沖液復(fù)溶來轉(zhuǎn)換溶劑，然后經(jīng)正已烷去脂凈化后分析。整個樣品前處理過程未使用價格昂貴的固相萃取小柱，節(jié)省了分析成本，且整個提取過程步驟簡單，易于操作。

4 結(jié)論

[1]劉艷萍，冷凱良，王清印，等.高效液相色譜法測定鰻魚中氟甲喹和喹酸的殘留量[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報，2009，18（3）：332 ～ 337.

[2]李耀平，李壽崧，吳文忠，等.出口歐鰻中喹酸殘留痕量檢測新技術(shù)研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14（2）：37 ～ 39.

[3]錢疆，李耀平，李壽崧.出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品喹酸殘留的HPLC監(jiān)控、驗(yàn)證檢測[J].福建分析測試，2002，11（3）：1606 ～ 1609.

[5]Harry V B.Analysis of oxolinic acid in fish by high—performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography，1990，530：75 ～ 82.