四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院 韓學(xué)易 李治國(guó) 陳 惠

木聚糖酶屬于水解酶類，是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系（蘇玉春等，2008）。目前研究和應(yīng)用較多的木聚糖酶多是來源于細(xì)菌、真菌和放線菌。較真菌所產(chǎn)木聚糖酶而言，細(xì)菌所產(chǎn)木聚糖酶具有更好的熱穩(wěn)定性（Panbangred等，1983）。本文報(bào)道了來自短小芽孢桿菌HZ-01產(chǎn)木聚糖酶基因的克隆及其序列分析，為下一步木聚糖酶的異源表達(dá)及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體與菌株 短小芽孢桿菌HZ-01由本實(shí)驗(yàn)室 （四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）自行篩選；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體購于TaKaRa公司。引物合成和基因測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司和北京諾賽基因組研究有限公司完成。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。

T4 DNA連接酶與Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）；DNA限制性內(nèi)切酶 （Fermentas公司）；DNA純化試劑盒 （TANGEN公司）；DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]；質(zhì)粒提取試劑盒（上海Omega生物技術(shù)有限公司）；蛋白胨和酵母粉（Oxoid 公司）；瓊脂糖（Amresco 公司）；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 木聚糖酶基因的擴(kuò)增 以短小芽孢桿菌HZ-01基因組DNA為模板，根據(jù)網(wǎng)上木聚糖酶基因序列設(shè)計(jì)引物：

PCR擴(kuò)增體系：總DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2X Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積 25 μL。 PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性 2 min，94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收，連接到T載體上，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。DNA測(cè)序由北京諾賽基因組研究有限公司完成。

1.4 木聚糖酶基因的序列分析 由網(wǎng)上提供的信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分子生物學(xué)軟件分析短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因的克隆 以短小芽孢桿菌HZ-01基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得到一條大小約700 bp的特異條帶（圖1）。將目的條帶回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，陽性克隆經(jīng)菌落PCR檢測(cè)（圖2）及測(cè)序鑒定，表明成功克隆目的基因。

2.2 木聚糖酶基因的序列分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究有限公司測(cè)序（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明，該木聚糖酶基因全長(zhǎng)687 bp，GC含量為43%，共編碼228個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為 25 kDa，等電點(diǎn)（pI）為 8.96。

采用NetNGlyc1.0在線分析軟件進(jìn)行短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶氨基酸序列N-糖基化位點(diǎn)（Asn-Xaa-Ser/Thr）的預(yù)測(cè)。在全長(zhǎng)氨基酸序列中共有4個(gè)Asn殘基可能被糖基化：當(dāng)閾值為0.5 時(shí)，分別為第 3、17、57、63 位。

利用MEGA4.0中codon usage對(duì)短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因密碼子使用頻率進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。由圖4可見，該木聚糖酶基因在密碼子選擇和使用上有明顯偏愛性，谷氨酸和半胱氨酸只出現(xiàn)一種密碼子，分別為GAA、UGU，亮氨酸未使用UUG、CUG，脯氨酸未使用CCC、CCG，異亮氨酸未使用AUA，丙氨酸未使用GCC，精氨酸密碼子使用具有明顯偏愛性，只出現(xiàn)CGU和AGA。

3 討論

周晨妍等（2005）采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了宇佐美曲霉 （Aspergillus usamii）E001木聚糖酶（Xyn II）成熟肽和3’非編碼區(qū)的cDNA片段，DNA序列分析表明，該cDNA全長(zhǎng)733 bp，其中3’非編碼區(qū)178 bp，成熟肽編碼區(qū)555 bp，編碼184個(gè)氨基酸。鄔敏辰等 （2007）以宇佐美曲霉E001基因組DNA為模板，采用單側(cè)PCR等技術(shù)擴(kuò)增了木聚糖酶基因xyn I的DNA全序列，該DNA全長(zhǎng)1098 bp，含啟動(dòng)子序列、內(nèi)含子和外顯子等核苷酸序列。白愛枝等 （2009）以黑曲霉（Aspergillus niger）A3的基因 組 DNA 為 模板，PCR擴(kuò)增出了木聚糖酶xynB基因，通過序列分析，xynB基因的cDNA序列大小為678 bp，編碼225個(gè)氨基酸。本研究從自主分離的短小芽孢桿菌HZ-01基因組中克隆了木聚糖酶基因，該基因全長(zhǎng)為687 bp，編碼228個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量約為25 kDa。

采用目前較為成熟的生物信息學(xué)在線分析數(shù)據(jù)庫和軟件包，來分析短小芽孢桿菌HZ-01木聚糖酶基因的糖基化位點(diǎn)和密碼子偏愛性，可以為其進(jìn)一步的異源高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。對(duì)其糖基化位點(diǎn)分析時(shí)，當(dāng)閾值為0.5時(shí)，氨基酸序列中共有4個(gè)潛在的 N-糖基化位點(diǎn)，分別為第 3、17、57、63位的Asn殘基。密碼子偏愛性分析表明，該木聚糖酶基因在密碼子選擇和使用上有明顯偏愛性，因此在進(jìn)行異源高效表達(dá)時(shí)需要針對(duì)不同宿主進(jìn)行高頻密碼子的定點(diǎn)突變或部分片段的人工合成。

本研究擬進(jìn)一步對(duì)其表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，并分別在大腸桿菌和畢赤巴斯德酵母中進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)木聚糖酶高效表達(dá)，對(duì)其功能研究及生產(chǎn)應(yīng)用均具有重要意義。

[1]白愛枝，閆祖威，唐國(guó)敏，等.黑曲霉木聚糖酶結(jié)構(gòu)基因和5’調(diào)控區(qū)基因克隆及其分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（5）：73 ～ 76.

[2]蘇玉春，陳光，白晶，等.木聚糖酶的研究進(jìn)展[J].牧草與飼料，2008，2（4）：14 ～ 18.

[3]鄔敏辰，王時(shí)良，周晨妍.木聚糖酶基因xyn I的克隆和序列分析[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27（6）：59 ～ 64.

[4]周晨妍，符丹丹，朱劼，等.宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆和序列分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：29 ～ 32.

[5]Beg Q，Kapoor M，Mahajan L，et al.Microbiol xylanases and their industrial applications：a review[J].Appl Microbiol Biotechnol，2001，56：326 ～ 338.

[6]Panbangred W，Shinmyo A，Kinoshita S，et al.Purification and properties of endoxylanase produced by Bacillus pumilus[J].Agric Biol Chem，1983，47：957～963.

[7]Wong K，Tan L，Saddler J.Multiplicity of in microorganisms:functions and applications[J].Microbiol Rev，1988，52：305 ～ 317.