魏文婷， 李 冰， 賈曄然， 陳 淼， 張紅璇△

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院平洲分院綜合科，廣東 佛山 528200； 2深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518100)

慢性阻塞性肺疾病患者肺組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達變化*

魏文婷1， 李 冰2， 賈曄然1， 陳 淼1， 張紅璇1△

(1廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學科學院平洲分院綜合科，廣東 佛山 528200；2深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東 深圳 518100)

目的檢測缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α HIF-1α)在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者肺組織標本中的表達及其在COPD發(fā)病過程中的作用。方法COPD病例組和對照組均16例，2組人群性別、年齡相匹配, 均為因肺部占位病變行肺葉切除術(shù)患者, 取材盡量遠離病變組織,利用Western blotting和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測2組人群肺組織標本中HIF-1α蛋白的表達。結(jié)果ELISA 檢測結(jié)果顯示COPD患者與對照組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平分別為(0.16±0.07) μg/L與(0.96±0.43) μg/L,Western blotting檢測結(jié)果顯示COPD患者與對照組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平分別為0.53±0.15和0.71±0.22，COPD病例組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。依據(jù)COPD疾病的嚴重程度將病例組人群分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕、中度COPD和重度COPD患者肺葉組織標本中HIF-1α蛋白水平分別為0.78±0.06和0.39±0.10；重度COPD患者肺葉組織標本中HIF-1α蛋白表達水平明顯低于輕中度COPD患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論HIF-1α在慢性阻塞性肺疾病的進展過程中表達減少，可能與疾病的發(fā)展相關(guān)。

缺氧誘導(dǎo)因子1α； 慢性阻塞性肺疾??； 蛋白質(zhì)印跡法； 酶聯(lián)免疫吸附試驗

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以不可逆性、進行性氣流阻塞為特征，與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)。COPD 的發(fā)病率和死亡率有逐年增加的趨勢[1-3]。然而對于COPD患者, 目前尚無有效阻止病程進展或根治的方法。因此, 探討COPD的發(fā)病機制, 對前瞻性地尋找COPD易患個體以及阻斷COPD的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。

缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)是哺乳動物細胞內(nèi)存在的一類隨細胞內(nèi)氧濃度變化而介導(dǎo)低氧適應(yīng)性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,是低氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)100多種靶基因的表達，與缺氧適應(yīng)、眾多炎癥因子的表達、免疫反應(yīng)、缺氧性肺動脈高壓密切相關(guān)，提示了其在慢性阻塞性肺疾病發(fā)生、發(fā)展中不可忽視的重要位置。有文獻指出, COPD 患者血清中的HIF-1α的表達水平要明顯高于無COPD者，但是關(guān)于COPD患者肺組織中 HIF-1α表達水平的研究尚未見到大量相關(guān)報道。本課題利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測2組人群肺組織標本中HIF-1α蛋白的表達水平，從而分析其在COPD發(fā)病過程中的作用。

材 料 和 方 法

1實驗對象及分組

全部研究對象選自廣東省人民醫(yī)院2012年5月～2012年11月因肺癌手術(shù)切除的肺組織標本。本研究經(jīng)過廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準, 并通過受試對象的知情同意。

COPD病例組(n=16)：COPD的診斷標準按照2007年全球慢性阻塞性肺疾病倡議(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD),所有病例均經(jīng)病史、體檢及相關(guān)檢查[如肺功能檢測:FEV1 (forced expiratory volume in one second)/FVC (forced vital capacity)和FEV1%predicted；X 射線胸部平片或胸部高分辨 CT等]確診為COPD(FEV1/FVC<70%,且FEV1 %predicted<80%)；且均根據(jù) X 線檢查(X光片和/或CT)及術(shù)中所見排除腫瘤所致阻塞性肺炎及腫瘤阻塞中央大氣道的情況。

對照組(n=16)：均為肺癌患者未合并COPD、支氣管哮喘/肺囊性纖維化、支氣管擴張或彌漫性細支氣管炎,且行肺功能測試提示 FEV1/FVC>70%predicted FEV1≥80%。

所有受試者在2 周內(nèi)無急性呼吸道感染。2組對象均為無民族間遺傳干擾(與其他民族人通婚)、無血緣關(guān)系的漢族人。

2實驗方法

2.1標本的獲取 實驗所用的肺組織取自盡量遠離肺癌病灶(距腫瘤8 cm以上), 肉眼觀察無肺癌浸潤的外周肺葉組織。手術(shù)取下肺組織標本,立即置入液氮罐中速凍, 然后將組織移存于深低溫冰箱 (-80 ℃) 中長期貯存, 避免組織的反復(fù)凍融。

2.2ELISA檢測肺組織勻漿中HIF-1α的含量 ELISA 試劑盒購于上海BG公司。取液氮中保存的等量肺組織(50～100 mg)盡量剪碎，冰浴條件下用超聲破碎儀充分勻漿后高速離心5 min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明進行檢測。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A值)，根據(jù)標準品A值繪制的標準曲線查出相應(yīng)細胞因子的濃度。

2.3Western blotting檢測肺組織中HIF-1α的含量 取液氮中凍存組織采用凱基全蛋白提取試劑盒進行蛋白抽提；BCA蛋白濃度測定試劑盒進行定量；等量樣品上12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜；PBS洗膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h；加入Ⅰ抗后4℃冰箱過夜。TBST洗膜3遍,每次10 min。加入Ⅱ抗后室溫30～40 min。TBST洗膜3遍,每次10 min。顯影液顯影, 凝膠成像儀獲取圖像, 用FluorChem 8900自動圖像分析軟件對HIF-1α光帶進行分析，以HIF-1α與β-actin蛋白條帶的灰度峰比值代表HIF-1α的表達量。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件分析。服從正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較用t檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

12組對象臨床資料的一般性描述

本研究采用群體樣本的一般性描述。健康對照組與COPD病例組人群間的性別、年齡、吸煙指數(shù)等無統(tǒng)計學意義，對照組的FEV1% predicted和FEV1/FVC明顯高于COPD病例組，見表1。

表1COPD病例組與對照組的臨床資料

Table 1. Comparison of age, sex, smoking index and lung fuction between COPD patients and healthy subjects(Mean±SD.n=16)

ItemCOPDControlSex(male∶female)9∶710∶6Age(year)63.44±9.1663.31±8.65Smokingindex362±457377±483FEV1/FVC(%)60.4±7.983.98±5.3FEV1%predicted55.1±11.7*89.7±12.3

*P<0.05vscontrol.

2COPD病例組及其對照組人群肺組織標本中HIF-1α的表達

2組人群肺組織標本中均能明顯表達HIF-1α蛋白。ELISA 檢測結(jié)果顯示COPD患者與對照組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平分別為(0.16±0.07) μg/L與(0.96±0.43) μg/L,Western blotting檢測結(jié)果顯示COPD患者與對照組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平分別為0.53±0.15和0.71±0.22，說明COPD病例組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。依據(jù)COPD疾病的嚴重程度將病例組人群分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕、中度COPD和重度COPD患者肺葉組織標本中HIF-1α蛋白水平分別為0.78±0.06和0.39±0.10；重度COPD患者肺葉組織標本中HIF-1α蛋白表達水平明顯低于輕、中度COPD患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The expression of HIF-1α in pulmonary tissues from COPD patients and healthy subjects determined by Western blotting.1,2：control;3,4： mild COPD;5,6：severe COPD.Mean±SD.n=16.*P<0.05vscontrol.

圖1COPD病例組及對照組肺組織標本中HIF-1α的表達

討 論

COPD是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部慢性疾病，是以產(chǎn)生低氧血癥為后果的常見病、多發(fā)??；HIF-1是哺乳動物細胞內(nèi)存在的低氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)，是由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α和結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β組成的異二聚體。其轉(zhuǎn)錄活性主要由HIF-1α的表達水平和穩(wěn)定性決定，氧對HFI-1活性調(diào)節(jié)主要通過該亞基受低氧誘導(dǎo)。已有大量研究表明HIF-1α與COPD之間的相互關(guān)系：胡瑞成等[4]實驗發(fā)現(xiàn)COPD患者肺部炎癥細胞增多，肺部炎癥細胞內(nèi)HIF-lα基因強陽性表達。李啟芳等[5]研究表明COPD患者肺血管有明顯的無肌細動脈肌化，中膜肌性增厚，血管壁增厚和管腔變窄; COPD患者肺小動脈HIF-1α mRNA及蛋白表達均明顯增強，與管壁厚度和管壁面積呈正相關(guān)，提示HIF-1α可能參與了COPD氣道重塑和肺動脈高壓形成的發(fā)病過程。然而，除了早產(chǎn)羔羊急性呼吸窘迫綜合癥[6]及急性心肌局部缺血再灌注損傷[7-8]以外，目前未見關(guān)于HIF-1α在肺組織中表達水平明顯降低的大量相關(guān)報道。2010年Yasuo等[9]的研究中指出，在重度COPD/肺氣腫病人肺組織以及肺動脈內(nèi)皮細胞和肺泡間隔細胞中，HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白表達量明顯降低，認為其與肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)在分子水平上遭到明顯損壞相關(guān)。

本課題以COPD及對照組肺葉組織標本為研究對象，利用ELISA法及Western blotting技術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，COPD病例組肺葉組織標本中HIF-1α 蛋白表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且病例組人群重度COPD患者肺葉組織標本中HIF-1α蛋白表達水平明顯低于輕中度COPD患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。眾所周知，氧化應(yīng)激反應(yīng)在人類COPD/肺氣腫肺組織及動物肺氣腫模型肺組織中普遍存在[10-12]；組蛋白脫乙酰酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)是轉(zhuǎn)錄過程中非常重要的核染色質(zhì)修飾酶，參與蛋白合成過程中的轉(zhuǎn)錄后修飾；p53基因是一種抑癌基因，細胞生長周期中的負調(diào)節(jié)因子，與細胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關(guān)。在COPD/肺氣腫病人肺組織中，缺氧引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可抑制HDAC2蛋白表達水平[13-14]而使p53蛋白的表達量增多[15]，同時HDAC2蛋白表達水平的下降可使p53蛋白表達水平上調(diào)[15]。最終HDAC2蛋白表達水平的下降和p53蛋白表達水平的上調(diào)導(dǎo)致COPD/肺氣腫病人血漿和肺組織中HIF-1α mRNA表達水平下降和HIF-1α蛋白表達量降低[16-17]。

綜上所述， COPD是以不可逆性、進行性氣流阻塞為特征的肺部慢性疾病，是一種慢性全身性炎癥綜合征[18]，HIF-1α是低氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)，與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在疾病的進展中有重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，重度COPD患者肺組織中HIF-1α的表達水平明顯下降，可能與肺組織遭到不同程度的破壞有關(guān)，進一步分析血漿及肺組織中HIF-1α表達水平與COPD嚴重程度之間的關(guān)系具有重大的臨床意義，值得進一步深入探討。

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Expressionofhypoxia-induciblefactor1αinpulmonarytissuesfrompatientswithchronicobstructivepulmonarydisease

WEI Wen-ting1, LI Bing2, JIA Ye-ran1, CHEN Miao1, ZHANG Hong-xuan1

(1ComprehensiveDepartment,BranchofPingzhou,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Foshan528200,China;LonggangCentralHospitalofShenzhenCity,Shenzhen518100,China.E-mail:sandyzhx@hotmail.com)

AIM: To study the expression of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in pulmonary tissues from patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) μg/L and its effects on the pathogenesis of COPD.METHODSPulmonary tissues were obtained from 32 subjects (16 patients with COPD and 16 without COPD as controls) who were undergoing single or bilateral lobectomy or wedge resection for lung cancer. The specimens were obtained as far away from the cancer foci (≥8 cm) as possible. The expression of HIF-1α protein in pulmonary tissues was measured by Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).RESULTSThe expression of HIF-1α protein in pulmonary tissues from controls and COPD patients was as follows: (0.96±0.43) μg/L and (0.16±0.07) μg/L (ELISA，P<0.05); 0.71±0.22 and 0.53±0.15 (Western blotting,P<0.05). Furthermore, the level of HIF-1α protein in pulmonary tissues from mild and moderate COPD patients was obviously higher than that from severe COPD patients (P<0.05).CONCLUSIONHIF-1α may play an important role in the progress of COPD.

Hypoxia-inducible factor 1α; Chronic obstructive pulmonary disease; Western blotting; Enzyme-linked immunosorbent assay

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1700- 04

2013- 04- 18

2013- 07- 26

廣東省科技基金資助項目 (No.2009B030801247)

△通訊作者 Tel: 020-85221779; E-mail： sandyzhx@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.029