劉 蜜， 王 琛， 王曉礽， 宋丹丹， 劉秀華△， 史大卓△

(1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091; 2解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

西洋參莖葉總皂苷通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞凋亡減輕大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)*

劉 蜜1， 王 琛1， 王曉礽2， 宋丹丹2， 劉秀華2△， 史大卓1△

(1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091;2解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

目的研究西洋參莖葉總皂苷 (Panaxquinquefoliumsaponin, PQS)對(duì)大鼠急性心肌梗死(AMI)后心室重構(gòu)的作用及其機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為假手術(shù) (sham) 組、AMI組、?；撬?(300 mg·kg-1·d-1) 組及PQS (50、100和200 mg·kg-1·d-1) 組 (n=15)。結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制AMI模型。術(shù)后第2天開(kāi)始，各用藥組用飲用水10 mL·kg-1·d-1溶解藥物灌胃，sham組及AMI組予等量飲用水灌胃。術(shù)后4周，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室結(jié)構(gòu)及功能變化；TTC染色法測(cè)定心肌梗死范圍；比色法測(cè)定非梗死區(qū)心肌組織羥脯氨酸含量；TUNEL法檢測(cè)非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白 (CRT)、C/EBP同源蛋白 (CHOP) 及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果與AMI組比較，PQS低、中、高劑量組左室收縮末期內(nèi)徑分別降低17.2%、20.3%和38.8%,左室舒張末期內(nèi)徑分別降低8.9%、9.0%和17.2%,左室收縮末期容積分別降低31.4%、38.5%和66.9%左室舒張末期容積分別降低18.2%、18.8%和34.2%,射血分?jǐn)?shù)分別升高44.9%、60.1%和118.0%,左室短軸縮短率分別升高55.4%、71.0%和148.0%，梗死范圍分別降低4.6%、39.5%和55.8% (均P<0.05)；非梗死區(qū)心肌組織羥脯氨酸含量分別降低34.5%、35.9%和48.7% (P<0.01)。與AMI組比較，PQS 200 mg·kg-1·d-1組心肌細(xì)胞凋亡率降低27.3% (P<0.05)，GRP78和CRT蛋白表達(dá)分別降低79.9%和80.8% (P<0.01)，CHOP和Bax分別降低42.5%和53.1% (P<0.01)，Bcl-2表達(dá)升高1.1倍 (P<0.01)；上述保護(hù)作用的程度與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?；撬嵯嘟?(P>0.05)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CHOP蛋白表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡率顯著正相關(guān) (r=0.797,P<0.01)。結(jié)論P(yáng)QS劑量依賴性減輕大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)，其機(jī)制與抑制CHOP介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路有關(guān)。

西洋參莖葉總皂苷； 心肌梗死； 心室重構(gòu)； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡

如何改善急性心肌梗死 (acute myocardial infarction, AMI) 后心室重構(gòu)、預(yù)防心力衰竭發(fā)生，是心肌梗死二級(jí)預(yù)防面臨的重大問(wèn)題。心肌梗死后心室重構(gòu)包括梗死區(qū)擴(kuò)展、心室擴(kuò)張和非梗死區(qū)代償性肥厚[1-3]，其機(jī)制涉及心肌細(xì)胞凋亡、肥大、延長(zhǎng)、側(cè)向滑移及心肌間質(zhì)纖維化等[2,4]。非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡在急性心肌梗死后心室重構(gòu)病理過(guò)程中具有十分重要的作用[5-8]。 心肌缺血可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress, ERS)[9]。持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可通過(guò)鈣超載、影響線粒體功能等誘發(fā)細(xì)胞凋亡[10-11]，表現(xiàn)為 ERS標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulated protein 78, GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin, CRT)的過(guò)表達(dá)及ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑C/EBP同源蛋白 (C/EBP homologous protein, CHOP)等的激活。我們前期研究證實(shí)，CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑參與了腹主動(dòng)脈狹窄所致的心肌肥厚過(guò)程[12]。

西洋參莖葉總皂苷 (Panaxquinquefoliumsaponin，PQS) 具有抗心肌缺血及心肌缺血再灌注后損傷的作用[13-14]，但PQS對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)是否有治療作用的報(bào)道較少。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，PQS可通過(guò)抑制過(guò)度ERS，減輕離體大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[15]。CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡是否參與了AMI后心室重構(gòu)的病理過(guò)程？PQS改善心肌梗死后心室重構(gòu)是否與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡有關(guān)？目前尚缺少研究。 因此，本研究采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型，觀察PQS改善AMI后心室重構(gòu)的作用；利用ERS抑制劑?；撬?taurine,Tau)作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，從CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡方面探討PQS改善心肌梗死后心室重構(gòu)的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物、試劑和儀器

清潔級(jí)8周齡健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20) g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。PQS粉 (純度為99.0%)由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供；?；撬豳?gòu)自Sigma；羥脯氨酸測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；丙烯酰胺 (acrylamide) 和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記 (TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) 試劑盒購(gòu)自Promega；兔抗人CRT和GRP78多克隆抗體購(gòu)自Stressgen；兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體和兔抗人Bax、Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自Cell Signal；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光 (enhanced chemiluminescence, ECL) 試劑盒購(gòu)自Millipore；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz；其余化學(xué)試劑，均購(gòu)自北京化工廠；小動(dòng)物呼吸機(jī) (DW-2000型) (上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn))；RM6240 BD多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng) (成都儀器廠生產(chǎn))；Vevo-770 小動(dòng)物超聲儀 (Visual Sonics生產(chǎn))。

2實(shí)驗(yàn)分組與急性心肌梗死模型復(fù)制

SD大鼠90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù) (sham)組、AMI組、Tau (300 mg·kg-1·d-1) 組及PQS (50、100和200 mg·kg-1·d-1) 組 (n= 15)。參考文獻(xiàn)[5]方法，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制心肌梗死模型。以2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠 (按100 g體質(zhì)量0.23 mL) 后，仰臥位固定大鼠，呼吸機(jī)輔助呼吸。左胸部縱切口，逐層分離，沿第4肋間開(kāi)胸，分離心包，暴露心臟，于左心耳下緣1 mm處以7-0線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。根據(jù)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖出現(xiàn)J點(diǎn)抬高 (≥ 0.2 mV)，判斷心肌梗死模型成功；sham組僅在相應(yīng)部位穿線，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。排除胸腔內(nèi)氣體，逐層關(guān)胸。自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管，縫合頸部皮膚。術(shù)后24 h，各用藥組用飲用水10 mL·kg-1·d-1溶解藥物灌胃4周，sham組及AMI組予等量飲用水灌胃4周。

3心臟超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

術(shù)后4 周時(shí)，將大鼠用 2% 異氟烷吸入麻醉后仰臥固定，通過(guò) Vevo-770 小動(dòng)物超聲儀獲取乳頭肌水平短軸切面，探頭頻率為17.5 MHz，每一數(shù)據(jù)均測(cè)量3次取均值。參考文獻(xiàn)[16]方法，檢測(cè)左室舒張末期內(nèi)徑 (left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑 (left ventricular end-systolic dimension, LVESD)、左室前壁舒張末期厚度 (left ventricular end-diastolic anterior wall, LVDAW)、左室前壁收縮末期厚度 (left ventricular end-systolic anterior wall, LVSAW)、左室后壁舒張末期厚度 (left ventricular end-diastolic posterior wall, LVDPW)、左室后壁收縮末期厚度 (left ventricular end-systolic posterior wall, LVSPW)、射血分?jǐn)?shù) (ejection factor, EF)和短軸縮短率 (fractional shortening, FS)。

4心肌梗死面積

以2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定大鼠，開(kāi)胸取出心臟，冰生理鹽水沖凈血液后將心臟垂直長(zhǎng)軸橫切為厚度均勻的5片，用絲線按順序?qū)⑿呐K切片串起置于37 ℃、2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)中孵育30 min。然后置于10%甲醛中過(guò)夜，封片。Image-Pro Plus 軟件測(cè)量面積。按照文獻(xiàn)[17]方法計(jì)算梗死面積，用梗死區(qū)面積 / (左室總表面積-左室腔面積) × 100%表示梗死范圍。

5心肌羥脯氨酸含量

取非梗死區(qū)心肌組織 (本研究中為左室后壁心肌組織)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，用比色法檢測(cè)心肌組織中羥脯氨酸的含量。

6心肌細(xì)胞凋亡

左心室結(jié)扎線以下垂直于心臟長(zhǎng)軸橫切厚約1 cm的心肌組織，置于10%甲醛溶液中固定, 經(jīng)石蠟包埋、切片 (2 μm)，HE染色和TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)[18]。熒光顯微鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈綠色。每張切片于非梗死區(qū)隨機(jī)取10個(gè)高倍視野 (× 40)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中每100個(gè)心肌細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例，以百分?jǐn)?shù) (%) 表示凋亡指數(shù) (apoptotic index, AI)。

7Westernblotting分析

取左室后壁心肌組織，按Liu等[19]介紹方法提取心肌細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，-80 ℃保存。取細(xì)胞蛋白提取液上清 (含蛋白100 μg) 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE, 10%分離膠)。電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% BSA封閉40 min后，分別加入CRT、GRP78、Bcl-2、Bax多克隆抗體和CHOP、GAPDH單克隆抗體 (均為1∶500)。4 ℃過(guò)夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，相應(yīng)Ⅱ抗孵育1.5 h?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的吸光度[integrated absorbance,IA=平均吸光度(A)× 面積]，以靶蛋白IA與GAPDHIA的比值反映靶蛋白水平。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD) 表示，采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。單因素方差分析 (One-way ANOVA) 進(jìn)行多組間比較，S-N-K法進(jìn)行多組間兩兩比較；CHOP蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性采用 Spearman 相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1一般情況

造模過(guò)程中由于麻醉意外、氣胸及術(shù)后24 h內(nèi)急性心力衰竭等原因死亡30只，術(shù)后24 h存活率為62.5%。Sham組大鼠，術(shù)后無(wú)感染和死亡。AMI組于術(shù)后第11天死亡1只，PQS低劑量組于第15天時(shí)死亡1只，死亡原因均為心衰 (解剖示心室腔擴(kuò)大、梗死區(qū)心室壁變薄、肺組織充血)。術(shù)后4周，sham組大鼠15只，PQS高、中劑量組及?；撬峤M大鼠各10只，AMI組和PQS低劑量組大鼠各9只。

2西洋參莖葉總皂苷對(duì)心肌梗死大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

2.1梗死范圍 TTC染色后存活心肌為紅色，梗死面積為白色。AMI組梗死范圍為 (32.0±5.9)%。與AMI組比較，PQS低、中、高劑量組梗死范圍分別降低4.6%、39.5%和55.8% (P<0.05)。PQS高劑量組與?；撬峤M比較無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of PQS on infarction size in transverse LV sections examined with TTC staining. Mean±SD.n= 3.#P<0.05vsAMI group;*P<0.05vsPQS 200 group.

圖1PQS對(duì)心肌梗死面積的影響

2.2超聲心動(dòng)圖 術(shù)后4周，各組間左室后壁厚度及左室質(zhì)量無(wú)顯著差異 (P>0.05)。與sham組比較，AMI組及PQS低、中、高劑量治療組均有左室內(nèi)徑及容積增加，左室前壁明顯變薄 (P<0.05)；與AMI組比較，PQS低、中、高劑量治療組左室前壁厚度無(wú)明顯差異 (P>0.05)，LVESD分別降低38.8%、20.3%和17.20% (P<0.05)，LVEDD分別降低17.2%、8.95%和8.91% (P<0.05)， EF分別升高1.2倍、60.1%和44.9% (P<0.05)，F(xiàn)S分別升高1.5倍、71.0%和55.4% (P<0.05)；PQS高劑量組與?；撬峤M比較，各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖2、表1。

Figure 2. Examples of M-mode echocardiograms obtained with two-dimensional guidance from a short-axis midventricular view from the sham-operated rat and the rats with 4-week-old anterior infarction. A: sham group; B: AMI group; C: PQS 50 mg·kg-1·d-1group; D: PQS 100 mg·kg-1·d-1group; E:PQS 200 mg·kg-1·d-1; F: the taurine group.

圖2各組大鼠M型超聲圖

表1PQS對(duì)心肌梗死后大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響

Table 1. Effects of PQS on the cardiac structure and functions of the rats after acute myocardial infarction (mean ±SD.n=4)

GroupLVDAW(mm)LVSAW(mm)LVESD(mm)LVEDD(mm)LVDPW(mm)LVSPW(mm)EF(%)FS(%)Sham1．6±0．12．5±0．33．5±0．37．5±0．41．7±0．23．0±0．483．3±1．353．9±1．4AMI0．2±0．1#0．2±0．1#9．1±0．6#10．7±0．8#1．7±0．22．4±0．329．9±6．7#15．0±3．7#Tau1．0±0．21．7±0．45．7±0．8#?9．0±0．5#?1．6±0．22．4±0．564．6±8．5#?37．3±6．4#?PQS500．6±0．40．8±0．67．5±1．7#?△9．7±0．9#?1．7±0．32．4±0．643．3±15．4#△23．3±10．2#PQS1000．6±0．50．9±0．77．2±1．1#?△9．7±0．5#?1．6±0．22．2±0．547．9±12．3#?△25．8±8．3#?PQS2000．9±0．31．5±0．55．5±0．3#?8．8±0．3#?1．7±0．22．7±0．365．1±2．7#?37．3±2．0#?

LVDAW: LV end-diastolic anterior wall; LVSAW: LV end-systolic anterior wall; LVEDD: LV end-diastolic diameter; LVESD: LV end-systolic diameter; LVDPW: LV end-diastolic posterior wall; LVSPW: LV end-systolic posterior wall; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsAMI group;△P<0.05vsPQS 200 group.

2.3心肌組織羥脯氨酸含量 用比色法檢測(cè)各組大鼠非梗死區(qū)心肌組織中羥脯氨酸的含量。與sham組比較，AMI組羥脯氨酸含量升高2.0倍 (P<0.01)；與AMI組比較，PQS低、中、高劑量組分別降低34.5%、35.9%和48.7% (P<0.01)。PQS組與?；撬峤M比較，心肌組織羥脯氨酸含量無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖3。

3西洋參莖葉總皂苷(200mg·kg-1·d-1)減輕心肌梗死后心室重構(gòu)作用機(jī)制的研究

3.1心肌組織細(xì)胞凋亡 與sham組比較，AMI組非梗死區(qū)心肌TUNEL陽(yáng)性率升高13.9倍 (P<0.01)。與AMI組比較，PQS組TUNEL陽(yáng)性率降低27.3% (P<0.01)，?；撬峤M降低27.9% (P<0.01)。PQS組與?；撬峤M之間無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. The effect of PQS (200 mg·kg-1·d-1) on hydroxyproline level of noninfarcted myocardium in SD rats.Mean±SD.n=4.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsAMI group.

圖3PQS對(duì)心肌梗死后大鼠心肌羥脯氨酸含量影響

Figure 4. The effect of PQS (200 mg·kg-1·d-1) on the myocardial tissue morphology (HE staining) and the apoptosis of noninfarcted myocardium (TUNEL staining) after myocardial infarction of SD rats.Mean±SD.n=4.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsAMI group.

圖4PQS對(duì)心肌梗死后大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率及心肌組織形態(tài)的影響

3.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78和CRT蛋白表達(dá) 與sham組比較，AMI組GRP78和CRT蛋白表達(dá)分別升高10.56倍和5.57倍 (P<0.01)。與AMI組比較，PQS組GRP78和CRT蛋白表達(dá)分別降低79.9%和80.8% (P<0.01)，Tau組GRP78和CRT蛋白表達(dá)分別降低81.0%和83.0% (P<0.01)。GRP78及CRT蛋白表達(dá)在PQS組和Tau組之間均無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖5。

3.3CHOP蛋白表達(dá) 與sham組比較，AMI組CHOP蛋白表達(dá)升高2.5倍 (P<0.01)。與AMI組比較，PQS組及Tau組CHOP蛋白表達(dá)分別降低42.5%和55.5% (P<0.01)。PQS組和Tau組的CHOP蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖6。

3.4Bax和Bcl-2表達(dá) 與sham組比較，AMI組非梗死區(qū)心肌中促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高6.2倍，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低75.5% (P<0.01)。與AMI組比較，PQS組促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低53.1% (P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高1.1倍 (P<0.01)。與AMI組比較，Tau組促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低67.4%，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高1.6倍 (P<0.01)。Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)在PQS組和Tau組之間均無(wú)顯著差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 5. The effects of PQS (200 mg·kg-1·d-1) on the protein expression of CRT and GRP78 of the noninfarcted myocardium in SD rats. Mean±SD.n= 4.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsAMI group.

圖5PQS對(duì)心肌梗死后大鼠非梗死區(qū)心肌GRP78和CRT蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 6. The effect of PQS (200 mg·kg-1·d-1) on the protein expression of CHOP of the noninfarcted myocardium in SD rats. Mean±SD.n= 4.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsAMI Fgroup.

圖6PQS對(duì)心肌梗死后大鼠非梗死區(qū)心肌CHOP表達(dá)的影響

Figure 7. The effects of PQS (200 mg·kg-1·d-1) on the protein expression of Bcl-2 and Bax of the noninfarcted myocardium in SD rats.Mean±SD.n=4.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsAMI group.

圖7PQS對(duì)心肌梗死后大鼠非梗死區(qū)心肌Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

4CHOP蛋白表達(dá)與非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

對(duì)心肌組織CHOP蛋白表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡率進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ERS 凋亡分子 CHOP 蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān) (r=0.797,P<0.01,n=4)。

討 論

急性心肌梗死可導(dǎo)致梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，繼而發(fā)生心室擴(kuò)張和心功能不全。心肌梗死后心室重構(gòu)在細(xì)胞水平的病理變化包括：(1) 病理性心肌細(xì)胞肥大伴隨胚胎性基因再表達(dá)；(2) 心肌細(xì)胞凋亡和壞死；(3) 細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積或降解增加[20]。本研究通過(guò)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌梗死，術(shù)后24 h開(kāi)始給予PQS (50、100和200 mg·kg-1·d-1)或牛磺酸 (300 mg·kg-1·d-1)。術(shù)后4 周超聲心動(dòng)圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，AMI組大鼠出現(xiàn)明顯左室前壁變薄、心室擴(kuò)張和心功能下降，證明模型復(fù)制成功。本研究中AMI組及用藥組大鼠均未表現(xiàn)出心肌梗死后存活心室壁代償性肥厚，可能與梗死后僅觀察4周，梗死后損傷修復(fù)時(shí)間較短有關(guān)。與AMI組比較，PQS可呈劑量依賴性顯著抑制心肌梗死后心室擴(kuò)張，改善心功能。本研究心肌組織TTC染色表明，PQS可顯著降低大鼠心肌梗死術(shù)后4周時(shí)心肌梗死面積。羥脯氨酸是心肌膠原特有的氨基酸，它可代表組織的膠原含量。本研究通過(guò)比色法檢測(cè)非梗死區(qū)羥脯氨酸含量發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，AMI組非梗死區(qū)的膠原含量明顯增加。與AMI組比較，PQS低、中、高劑量組均有羥脯氨酸含量降低，且呈劑量依賴性。這提示PQS可明顯降低心肌梗死后心肌組織膠原含量，改善心室重構(gòu)?？傊?，PQS低、中、高劑量組均明顯減輕心肌梗死后大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化、功能損傷和纖維化程度。

Palojoki等[5]通過(guò)結(jié)扎Wistar大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后4周時(shí)非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，且心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量與心室舒張末期內(nèi)壓呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周，與sham組比較，AMI組非梗死區(qū)TUNEL陽(yáng)性的心肌細(xì)胞顯著增多。本研究選取降低心肌梗死面積、改善心室重構(gòu)作用最明顯的PQS 200 mg·kg-1·d-1治療組為藥物治療組，進(jìn)一步研究PQS對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)的保護(hù)機(jī)制。與AMI組比較，PQS (200 mg·kg-1·d-1) 可顯著降低非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率。提示200 mg·kg-1·d-1的PQS治療能夠減少非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。

ERS相關(guān)凋亡途徑可參與不同誘因所致心室重構(gòu)的病理過(guò)程：在主動(dòng)脈收縮環(huán)導(dǎo)致心肌肥大心力衰竭小鼠模型中，GRP78和CHOP表達(dá)顯著增加[21]；Xin等[22]在小型豬左冠狀動(dòng)脈前降支根部放置收縮環(huán)，誘導(dǎo)慢性心肌缺血心力衰竭，發(fā)現(xiàn)ERS相關(guān)凋亡的CHOP、JNK (c-Jun N-terminal kinase)和caspase-12三條途徑均可參與慢性心肌缺血導(dǎo)致心衰；陳鵬等[23]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的CHOP、JNK和caspase-12三條通路均參與了心梗后心衰中心肌細(xì)胞的凋亡；我們前期利用腹主動(dòng)脈狹窄，誘導(dǎo)大鼠高血壓心肌肥厚，發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈狹窄可誘導(dǎo)ERS相關(guān)CHOP途徑，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[12]。CHOP介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路與線粒體凋亡途徑有密切聯(lián)系，CHOP 可通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax從胞漿向線粒體內(nèi)易位[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，AMI組非梗死區(qū)心肌中GRP78、CRT、CHOP和Bax蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。這提示CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡參與了心肌梗死后心室重構(gòu)。外源性?；撬峥梢砸种撇煌蛘T導(dǎo)的多種細(xì)胞的ERS反應(yīng)[25-26]，本研究發(fā)現(xiàn)，與AMI組比較，ERS抑制劑?；撬峥娠@著降低非梗死區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡率及非梗死區(qū)心肌組織GRP78、CRT、CHOP及Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)一步提示ERS參與了心肌梗死后非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程。PQS (200 mg·kg-1·d-1) 灌胃4周，可顯著降低GRP78、CRT、CHOP及Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)。這提示PQS可通過(guò)抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡，減輕心肌梗死后心室重構(gòu)。

Qin等[7]結(jié)扎兔冠狀動(dòng)脈誘導(dǎo)心肌梗死，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡涉及到線粒體相關(guān)凋亡蛋白細(xì)胞色素C等的改變。本研究采用Spearman相關(guān)性分析，AMI組非梗死區(qū)心肌組織CHOP蛋白表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡率的相關(guān)系數(shù)0.797 (P<0.01)，提示在CHOP蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡率密切相關(guān)，CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡參與了心肌梗死后心室重構(gòu)過(guò)程。但是，CHOP介導(dǎo)相關(guān)凋亡僅是細(xì)胞凋亡途徑的一部分，是否有線粒體凋亡途徑及ERS的其它相關(guān)凋亡途徑參與心肌梗死后心室重構(gòu)的病理過(guò)程，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，PQS可改善心肌梗死后心室擴(kuò)張和心功能，降低非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率，其作用機(jī)理與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑有關(guān)，表現(xiàn)為降低心肌梗死誘導(dǎo)的GRP78、CRT和CHOP蛋白表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)。

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Panaxquinquefoliumsaponinattenuatesventricularremodelingafteracutemyocardialinfarctioninratsbyinhibitingendoplasmicreticulumstress-relatedapoptosis

LIU Mi1, WANG Chen1, WANG Xiao-reng2, SONG Dan-dan2, LIU Xiu-hua2, SHI Da-zhuo1

(1XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China;2DepartmentofPathophysiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:xiuhualiu98@yahoo.com.cn;heartmail@263.net)

AIM: To investigate the effect ofPanaxquinquefoliumsaponin (PQS) on ventricular remodeling after acute myocardial infarction (AMI) in rats and its mechanism.METHODSNinety healthy male SD rats were randomly divided into sham group, AMI group, taurine 300 mg·kg-1·d-1group, PQS 50 mg·kg-1·d-1group, PQS 100 mg·kg-1·d-1group and PQS 200 mg·kg-1·d-1group. AMI models were produced by ligating the left coronary arteries in SD rats. The rats in each treatment group were gavaged with drugs dissolved in water (10 mL·kg-1·d-1), and the rats in sham group and AMI group

equal volume of water. Four weeks after MI, the left ventricle fractional shortening, ejection fraction and structure were evaluated by echocardiography. Myocardial infarct size was measured by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining. The hydroxyproline level was measured by colorimetric method. Apoptosis of the cardiomyocytes was detected by TUNEL. In addition, the expression of endoplasmic reticulum stress-related molecules in the noninfarcted myocardium was determined by Western blotting.RESULTSCompared with AMI group, the left ventricular end-systolic dimension in PQS 50 mg·kg-1·d-1group, PQS 100 mg·kg-1·d-1group and PQS 200 mg·kg-1·d-1group decreased by 17.2%, 20.3% and 38.8% respectively,and the left ventricular end-diastolic dimension decreased by 8.91%, 8.95% and 17.20%, respectively.The left ventricular end-systolic volume decreased by 31.4%, 38.5% and 67.0%, respectively, and the left ventricular end-diastolic volume decreased by 18.2%, 18.8% and 34.2%, respectively.The left ventricular ejection fraction increased by 44.9%, 60.1% and 118.0%， respectively,and the fractional shortening increased by 55.4%, 71.0% and 148.0%， respectively.The infarction size decreased by 4.6%, 39.5% and 55.8%， respectively,and the hydroxyproline level in noninfarcted myocardium decreased by 34.5%, 35.9% and 48.7%, respectively. Compared with AMI group, the myocardial apoptotic index in PQS 200 mg·kg-1·d-1group decreased by 27.3%, the protein expression of Bcl-2 increased by 114.0%, and that of Bax, GRP78, CRT and CHOP decreased by 53.1%, 79.9%, 80.8% and 42.5%， respectively. The above mentioned protective effects in PQS 200 mg·kg-1·d-1group and taurine group were similar. The Spearman correlation analysis revealed that CHOP expression had significant positive correlation with apoptotic index (r=0.797,P<0.01).CONCLUSIONPQS attenuates ventricular remodeling in rats. The underlying mechanism may be associated with the inhibition of CHOP-mediated endoplasmic reticulum stress-related cardiomyocyte apoptosis.

Panaxquinquefoliumsaponin; Myocardial infarction; Ventricular remodeling; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

R361.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.005

1000- 4718(2013)05- 0796- 08

2012- 10- 16

2013- 03- 18

國(guó)際科技合作項(xiàng)目 (No. 2010DFA31690); 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 81070130)

△通訊作者 劉秀華 Tel: 010-66939774; E-mail: xiuhualiu98@yahoo.com.cn; 史大卓 Tel: 010-62860499; E-mail: heartmail@263.net