杜美麗，張永紅，呂利華，劉堅(jiān)，陳學(xué)英，趙良啟＊

（1.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006；2山西醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001；3山西省醫(yī)用組織庫(kù)，山西 太原 030006）

創(chuàng)傷和骨性關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)骨軟骨損傷是臨床上的一種常見(jiàn)病，但由于軟骨自身修復(fù)能力極弱，使得關(guān)節(jié)骨軟骨損傷修復(fù)成為醫(yī)學(xué)難題之一［1－2］.傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)骨軟骨損傷治療方法雖然取得了一些臨床效果，但分別呈現(xiàn)出不同的醫(yī)學(xué)缺陷與不足，如供體不足、供區(qū)繼發(fā)性受損、免疫排斥等，長(zhǎng)期療效不夠理想［3］.1994年Vacanti等［4］首次將組織工程學(xué)引入關(guān)節(jié)骨軟骨損傷修復(fù)研究，為關(guān)節(jié)損傷修復(fù)開(kāi)辟了新途徑.關(guān)節(jié)骨軟骨組織工程研究包括支架、生長(zhǎng)因子和種子細(xì)胞三大部分，其中支架制備是最重要的基礎(chǔ)工作之一.制備支架曾經(jīng)歷了單層支架、雙層支架研究階段.初期是分別制備軟骨、硬骨單層支架，通過(guò)縫合／黏合組成兩層關(guān)節(jié)支架.這種關(guān)節(jié)支架的缺陷是兩層連接不緊密，容易分離或脫落.于是人們開(kāi)始研究一次制備骨軟骨雙層支架，較好地解決了雙層分離的問(wèn)題，但未能解決阻止血管進(jìn)入軟骨部分的問(wèn)題.為此，參照關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)，研制仿生多層一體化關(guān)節(jié)組織工程支架成為新課題.

本實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)出一種新型生物材料——羥基丁酸與羥基辛酸共聚體［P（HB－HO）］，該材料具有良好的可塑性、加工性、生物相容性、生物可降解性和降解產(chǎn)物無(wú)毒性等特性［5］.本文通過(guò)溶劑澆鑄／顆粒瀝濾法［6－7］技術(shù)路線，以PHBHOx為連續(xù)相，研制骨層、過(guò)渡層、軟骨層一體化仿生關(guān)節(jié)組織工程支架，優(yōu)化支架制備條件和支架性能，并進(jìn)行支架與細(xì)胞的復(fù)合培養(yǎng)試驗(yàn)，為該一體化支架修復(fù)關(guān)節(jié)損傷研究提供技術(shù)支撐與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料：羥基丁酸與羥基辛酸共聚體（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所）、一周齡新西蘭白兔（購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)）、豬骨頭（購(gòu)自太原市田和食品集團(tuán)有限公司）

1.2 主要儀器：RGT1－20A萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（深圳瑞格爾儀器有限公司），JSM－6701F掃描電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），酶聯(lián)標(biāo)記檢測(cè)儀（美國(guó)BioRad－550型）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豬膝關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

為了制備軟骨層復(fù)合材料，參照改良的Courtman法［8］對(duì)關(guān)節(jié)軟骨行脫細(xì)胞處理后，進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)、Masson染色.

1.3.2 軟骨層／過(guò)渡層／硬骨層一體化關(guān)節(jié)支架制備條件優(yōu)化

各層支架的制備：氯仿溶液溶解PHBHOx及復(fù)合材料（脫細(xì)胞基質(zhì)、β－磷酸三鈣），加入一定粒徑NaCl顆粒作為致孔劑充分混勻，置于自制模具內(nèi)，壓實(shí)常溫干燥后脫模，蒸餾水浸泡去除NaCl，真空干燥至恒質(zhì)量.

一體化支架的制備：選擇各層支架的最優(yōu)參數(shù)，以PHBHOx為連續(xù)相，氯仿為溶劑，在同一模具內(nèi)連續(xù)制作3層支架，常溫壓實(shí)干燥后，脫模去鹽制得軟骨層／過(guò)渡層／骨層PHBHOx一體化關(guān)節(jié)組織工程支架.

1.3.2.1 孔隙率的測(cè)定：采用比重法［9］，在25℃條件下進(jìn)行孔隙率測(cè)定.

1.3.2.2 力學(xué)強(qiáng)度的測(cè)定：萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架的抗壓強(qiáng)度，支架為直徑10mm、高度15mm的圓柱狀.測(cè)試時(shí)以5mm／min加載速率進(jìn)行，測(cè)定受力壓縮達(dá)30%時(shí)的荷載，計(jì)算抗壓強(qiáng)度.計(jì)算公式：

其中бc、P、A分別代表抗壓強(qiáng)度（Pa）、壓縮30%時(shí)的荷載（N）及試樣面積（m2）.

1.3.2.3 掃描電鏡觀察：將支架切成6mm×3mm×3mm的長(zhǎng)方體，真空噴金后，觀察支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及孔徑大小.

1.3.2.4 吸水率的測(cè)定：將支架切成質(zhì)量大體相同的6塊并稱重記為m0，然后將其放在PBS緩沖液中，每隔1h用濾紙吸干稱重記為m1.計(jì)算公式為

1.3.3 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與關(guān)節(jié)一體化支架的復(fù)合培養(yǎng)

將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）與關(guān)節(jié)一體化支架進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，檢測(cè)支架對(duì)BMSC生長(zhǎng)和增殖的影響.

1.3.3.1 BMSC的分離：采用全骨髓分離法［10］提取并分離BMSC，接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)，首次24h換含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的L－DMEM液，以后每隔3d換液.

1.3.3.2 BMSC在支架上的生長(zhǎng)情況：取第二代BMSCs，質(zhì)量濃度0.25%的胰酶消化后調(diào)整濃度至1.0×103個(gè)／mL，在96孔板內(nèi)放置20塊相同規(guī)格的經(jīng)消毒過(guò)的支架，將細(xì)胞懸液用移液槍滴注于支架上，每塊材料接種150μL.在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4h后，每孔加入培養(yǎng)液200μL充分覆蓋材料，作為實(shí)驗(yàn)組.將細(xì)胞以1.0×103／mL直接接種于96孔板內(nèi)作為對(duì)照組.培養(yǎng)10d后經(jīng)MTT法處理后在酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定490nm處的OD值.所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析.

1.3.3.3 細(xì)胞在支架上的黏附情況：將支架切成體積大小相似的小塊并用體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸泡24h，再用L－DMEM浸泡12h，在超凈臺(tái)上紫外線照射30min，然后將細(xì)胞滴加在支架上復(fù)合培養(yǎng)7d，用體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定24h，體積分?jǐn)?shù)10%、30%、50%、70%、90%的酒精梯度脫水，自然晾干后真空噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上的黏附情況.

2 結(jié)果

2.1 豬膝關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備結(jié)果

將脫細(xì)胞基質(zhì)（ACTM）石蠟包埋、切片、倒置顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1（P110）.經(jīng)HE染色，細(xì)胞中空，無(wú)細(xì)胞核殘留，只有細(xì)胞外基質(zhì)（紅色）（圖1a）.經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，細(xì)胞外基質(zhì)呈深藍(lán)色，表明蛋白多糖呈陽(yáng)性（圖1b）.經(jīng)Masson染色，細(xì)胞外基質(zhì)呈藍(lán)色，表明膠原呈陽(yáng)性（圖1c）.結(jié)果顯示：豬軟骨細(xì)胞已去除干凈，僅保留了細(xì)胞外基質(zhì)成分，表明該脫細(xì)胞基質(zhì)不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，可用于BMSC培養(yǎng).

2.2 支架各層支架制備條件優(yōu)化及關(guān)節(jié)一體化支架制備結(jié)果

以孔隙率和力學(xué)強(qiáng)度為主要技術(shù)指標(biāo)，進(jìn)行了單因素優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1（P110）.結(jié)果顯示，致孔劑的粒徑和含量分別影響著支架的孔徑大小、孔隙率及力學(xué)強(qiáng)度，支架的孔隙率與NaCl含量成正比，力學(xué)強(qiáng)度與NaCl含量及β－TCP、ACTM含量成反比.根據(jù)人體骨軟骨組織工程對(duì)各層的要求：軟骨層選擇ACTM／PHBHOx質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、NaCl／PHBHOx為4g／g；過(guò)渡層選擇 NaCl／PHBHOx為3g／g；硬骨層選擇β－TCP／PHBHOx質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、NaCl／PHBHOx為4g／g.

圖1 豬膝關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的染色觀察（×400）Fig.1 Staining observation of pig knee joint acellular matrix

表1 軟骨層、過(guò)渡層、硬骨層性能測(cè)定Table 1 Performance test of cartilage，interlayer and bone

按照各層支架優(yōu)化后的技術(shù)參數(shù)制作一體化支架.一體支架的光學(xué)照片見(jiàn)圖2a，圓柱狀、白色、表面粗糙.支架分為三層，上層為軟骨層，中間為過(guò)渡層，下層為硬骨層.由支架的橫截面電鏡照片（圖2b）可以看出支架各層連接緊密，由圖2c可以看出層內(nèi)與層間孔道相通，連通性良好.由圖2d、2e、2f電鏡圖可以看出支架的孔徑大小與致孔劑的粒徑大小有關(guān)，軟骨部分孔徑大小為（125±10）μm、過(guò)渡層孔徑為（30±5）μm左右、硬骨部分孔徑大小為（300±35）μm.

圖2 支架宏觀圖及電鏡圖Fig.2 Microstructure and SEM of scaffold

從表2（P111）可以看出支架在1h時(shí)吸水率已經(jīng)達(dá)到75%以上，5h時(shí)吸水率劇增達(dá)到200%以上.這說(shuō)明支架的吸水率很好，為后期BMSC與支架的復(fù)合培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ).

表2 一體化支架的吸水率Table 2 Water absorption of integrative scaffold

2.3 BMSC與關(guān)節(jié)一體化支架的復(fù)合培養(yǎng)

經(jīng)全骨髓分離法提取得到BMSC，在首次換液后的第2天出現(xiàn)零星的貼壁細(xì)胞，見(jiàn)圖3a.在第5天時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)漩渦狀的細(xì)胞群，見(jiàn)圖3b.在第9天時(shí)，細(xì)胞增殖融合達(dá)到整個(gè)細(xì)胞瓶底的80%以上，見(jiàn)圖3c.全骨髓分離法提取的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，在換液過(guò)程中逐漸去除不貼壁的雜細(xì)胞，得到純BMSC.

圖3 倒置顯微鏡下觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（×100）Fig.3 Observation of rabbit bone marrow stromal cells under inverted microscope（×100）

將第二代BMSC與支架共培養(yǎng)10d后經(jīng)MTT法檢測(cè)得到的結(jié)果（表3）.進(jìn)行t檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析.可見(jiàn)空白軟骨、空白硬骨與對(duì)照組二者之間差異非常顯著（P＜0.01），說(shuō)明支架適合細(xì)胞的生長(zhǎng).復(fù)合軟骨與空白軟骨二者之間差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明ACTM為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)；復(fù)合硬骨與空白硬骨二者之間差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明添加了β－TCP后支架表面更加粗糙，有利于細(xì)胞的黏附.

表3 細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)Table 3 Cell growth on the scaffold

圖4 掃描電鏡下觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附在支架上Fig.4 Rabbit bone marrow stromal cells were attached to scaffold under SEM

掃描電鏡觀察表明，BMSC在支架的軟骨層和硬骨層都可以完全黏附，而且細(xì)胞表面有分泌物的產(chǎn)生（圖4a、4b），表明一體化支架無(wú)毒，且內(nèi)部結(jié)構(gòu)適宜細(xì)胞的生長(zhǎng).

3 討論

關(guān)節(jié)骨軟骨擁有復(fù)雜的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，從軟骨頂層到硬骨依次為軟骨儲(chǔ)備區(qū)、軟骨增生區(qū)、軟骨成熟區(qū)、軟骨鈣化區(qū)、成骨區(qū)，如果嚴(yán)格按照關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)支架比較困難，因此在支架制備時(shí)設(shè)計(jì)了一個(gè)過(guò)渡層而代之.過(guò)渡層的致孔劑粒徑≤38μm，獲得的孔徑約在30μm左右，可以阻止成骨細(xì)胞的遷移以及血管伸入軟骨部分.將過(guò)渡層的孔隙率控制在70%以上，以便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的交換輸送.

在軟骨部分復(fù)合了ACTM，為BMSC的生長(zhǎng)、增殖、分化提供了營(yíng)養(yǎng)成分并促進(jìn)軟骨組織形成.硬骨部分復(fù)合了β－TCP，β－TCP有較強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度，其表面部分遇水后會(huì)形成羥基磷灰石結(jié)晶，成為硬骨的主要無(wú)機(jī)成分，很好的仿生了骨的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，也使支架表面更加粗糙有利于BMSC的黏附.

采用溶劑澆鑄－粒子濾瀝法，制備軟骨層／過(guò)渡層／硬骨層三層一體化支架的過(guò)程中，以PHBHOx為連續(xù)相，建立了分步操作一次成型新工藝.

BMSC與支架復(fù)合培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明支架不僅對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，而且為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了良好的生存環(huán)境.這一結(jié)果也說(shuō)證實(shí)在支架制備過(guò)程中沒(méi)有氯仿殘留.

關(guān)節(jié)一體化組織工程支架的成功制作，僅為關(guān)節(jié)組織工程研究奠定了支架基礎(chǔ)，接下來(lái)尚有一系列的研究工作有待進(jìn)行，如生長(zhǎng)因子的介入及體內(nèi)外的細(xì)胞及組織培養(yǎng)、關(guān)節(jié)損傷修復(fù)的動(dòng)物試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)等.

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