何 舟，陳 新，楊 桃，李 龍，胡 海，許 旭

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

箬葉為禾本科(Graminales)竹亞科(Bambusoideae Nees)箬竹屬(Indocalmus)植物葉的總稱，該屬約含20種，均產(chǎn)我國［1］。箬葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽的功能［2］。臨床應(yīng)用于治療呼吸道感染、頭痛咽痛等疾病［3］。一是抗菌及抗病毒，二是抗炎解熱、抗腫瘤［4］。箬葉中含有大量的黃酮類化合物，從九十年代開始人們對黃酮類活性物質(zhì)研究就開始了，主要表現(xiàn)為抗氧化、分離純化等方面。近年來，國內(nèi)外學(xué)著對黃酮化合物抑制微生物的研究逐步深入，最新的研究結(jié)果表明，箬葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸類化合物、葸醌類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等都有著較強(qiáng)的抑菌殺菌作用［5］。箬葉提取物對大腸桿菌、枯草牙孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金牙孢桿菌具有廣泛的抑制作用，其抑制效果隨作用時間延長和使用提取液濃度的提高而增強(qiáng)［6］。箬葉中有效抑菌活性成分提取具有重大意義，箬葉中有效抑菌活性成分提取物在金黃色葡萄球菌，大腸桿菌這類細(xì)菌上抑菌效果顯著［7］，開發(fā)這類抑菌藥物前景廣大［8］。

本實驗首先探討不同提取液對箬葉抑菌活性的影響，確定采用水提取箬葉中抑菌活性成分，進(jìn)而擬定箬葉水提液抑菌作用為觀測指標(biāo)，利用單因素和響應(yīng)面實驗優(yōu)化提取工藝，旨在探討該方法提取的最佳工藝，為進(jìn)一步提取利用箬葉中抑菌活性成分貢獻(xiàn)有重大價值的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

箬葉，由武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院實驗室提供

1.1.2 試劑儀器

氫氧化鈉(AR)、氯化鈉(AR)、冰醋酸(AR)、乙醇(AR)、石油醚(AR)、氯仿(AR)、正丁醇(AR)、乙酸乙酯(AR)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl5.0 g/L，pH7.0—7.2;供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.arueus)大腸桿菌(Escherichia.coli)，由武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院實驗室提供

AL204－01型電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司;RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠;SPX－300BSH－II型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;HQ45Z型恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司;JJ－CJ－2FD型超凈工作臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司;752N可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提取液制備樣品方法比較

用箬葉制備水提液備用，其中一份加入醋酸另一份不作處理。用箬葉制備醇提液備用，(乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%，40%，50%，60%，70%)其中一份加入醋酸另一份不作處理。利用提取液進(jìn)行抑菌實驗，測定抑菌圈大小。由于醋酸對提取液抑菌效果具有協(xié)同作用，使抑菌效果更為明顯，故設(shè)置酸抑菌對比實驗。

1.2.2 箬葉水提取法的單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試

以抑菌圈直徑為評價標(biāo)準(zhǔn)，首先擬定提取溫度、料液比、提取時間進(jìn)行單因素試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗工藝參數(shù)范圍，采用Box－Behnken設(shè)計方案，并進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的線性擬合和方差分析確定箬葉抑菌活性成分提取的最佳工藝。

1.2.3 樣品及對照組的箬葉抑菌活性實驗

將直徑為6 mm的濾紙片盛于培養(yǎng)皿中滅菌，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，121—126℃滅菌30 min后置于50℃烘箱內(nèi)烘2 h，將濾紙片放入分別置不同濃度的供試樣品中，浸泡30 min。對照組用無菌蒸餾水浸泡30 min。將滅過菌的鑷子取濾紙圓片，無菌操作放入菌液平板上(每個皿正六邊形對稱放6張濾紙圓片，其中三片用蒸餾水對照)，做三次重復(fù)實驗。細(xì)菌平板倒置37℃恒溫培養(yǎng)18—24 h，測定抑菌圈直徑，計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取液對箬葉抑菌活性影響

準(zhǔn)確稱取箬葉200 g，置3 000 mL燒瓶中，箬葉比水為1∶10比例加入蒸餾水，60℃恒溫水浴加熱，備用。將濾液濃度配制成2 g/mL，其中一份加入體積比(藥液:醋酸20∶1)的醋酸，另一份不作處理，醇提取方法同上，另外配制2 g/mL的醋酸溶液，結(jié)果見表1和圖1。

表1 水和一定體積分?jǐn)?shù)醇加酸前后抑菌效果比較

圖1 水和一定體積分?jǐn)?shù)醇加酸前后抑菌效果比較

從左至右依次為大腸桿菌水提液，大腸桿菌水提液加酸，金黃色葡萄球菌水提液，金黃色葡萄球菌水提液加酸。通過圖1和表1可以得到，提取液加酸后抑菌效果比不作處理的顯著。大腸桿菌抑菌效果普遍大于金黃色葡萄球菌，故下面抑菌實驗中選擇大腸桿菌為觀測指標(biāo)菌。

2.2 箬葉提取工藝單因素實驗

2.2.1 提取溫度對箬葉水提取物抑菌活性影響

圖2至圖4中，菱形折線代表大腸桿菌抑菌效果曲線，正方形折線代表金黃色葡萄球菌抑菌效果曲線。

由圖2得到，當(dāng)溫度達(dá)60℃時箬葉提取物抑菌活性成分對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果都達(dá)到最強(qiáng)，故選擇最佳提取溫度為60℃。

圖2 提取溫度對箬葉水提取物抑菌活性影響

2.2.2 料液比對箬葉水提取物抑菌活性影響

由圖3得到，隨著料液比值的增加，箬葉活性物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制微慢上升后趨于平緩。為了節(jié)約成本，選擇料液比1∶10(g∶mL)最佳。

圖3 料液比對箬葉水提取物抑菌活性影響

2.2.3 提取時間對箬葉水提取物抑菌活性影響

由圖4得到:隨著提取時間的增加，箬葉提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果逐漸增強(qiáng)。提取時間增加至2.5 h后，箬葉活性物對兩種菌的抑制效果趨于平衡，故選擇最佳提取時間2.5 h。

圖4 提取時間對箬葉水提取物抑菌活性影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Design－Expert.v8.0.6響應(yīng)面實驗之中心組合實驗Box－Behnken設(shè)計方案［9］。選三個因素:提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)，以抑菌圈(Y)為指標(biāo)見表2、表3。并對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合和方差分析，考察因素顯著性見表4。根據(jù)回歸方程，響應(yīng)面曲線圖，等高線圖，分析各因素交互作用的顯著性，得出實驗結(jié)果(見圖5—圖7)。

對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得各因素與抑菌圈大小的二次多項回歸方程為

表2 Box－Behnken響應(yīng)面實驗因素與水平

表3 Box－Behnken響應(yīng)面實驗

表4 擬合二次多項式模型的方差分析

由表4可以看出:抑菌效果顯著性大小依次為B＞A＞C。方程復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9843，說明該模型顯著性好;失擬性大于0.05不顯著，說明方程誤差小。Radj 2=0.964 0，說明該模型能夠反映96.40%響應(yīng)值的變化，較好反映提取條件對抑菌效果的變化規(guī)律。

圖5

圖6

圖7

由圖5至圖7可知:提取時間與液料比相互作用極為顯著(P=0.0093＜0.01)，提取溫度與液料比相互作用對抑菌圈影響較為顯著(P=0.0339＜0.05)，提取時間與提取溫度相互作用不是很顯著(P=0.4561 ＞0.01)。

通過響應(yīng)面優(yōu)化箬葉抑菌活性成分抑菌最佳提取工藝條件:提取溫度50℃，提取時間2.89 h，液料比9.44。抑菌圈預(yù)測值14.073 5 mm。對提取最佳工藝進(jìn)行修正:提取溫度50℃，提取時間3 h，料液比1∶10(g∶mL)，抑菌圈實際值13.873 5 mm。實際值與預(yù)測值差異較小，說明響應(yīng)面模型優(yōu)化設(shè)計適合箬葉抑菌活性成分提取工藝。

3 結(jié)論

本文進(jìn)行不同提取液對箬葉抑菌活性影響探討，得出結(jié)論:水提取效果優(yōu)于醇提取，提取液加酸后抑菌效果比不作處理的顯著，大腸桿菌抑菌效果普遍大于金黃色葡萄球菌。故后續(xù)實驗選擇大腸桿菌為觀測指標(biāo)菌。

利用抑菌實驗，對箬葉抑菌活性部位水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實驗得到最佳提取條件:提取溫度50℃，料液比1∶10(g∶mL)，提取時間3 h。抑菌圈大小為13.8735 mm。結(jié)果表明箬葉水提取液對大腸桿菌表現(xiàn)出較好抑菌效果，開發(fā)箬葉中有效抑菌活性成分意義深遠(yuǎn)。

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