馬利芹，霍曉青，利 凱，董世山

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院，河北 張家口 075131；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071000）

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，病毒性傳染病已經(jīng)成為危害畜禽的主要疾病。目前對病毒病的防治主要是采取疫苗防治，化學(xué)合成藥物及外源性細(xì)胞因子治療等手段。疫苗免疫是最常用的方法，但由于病毒血清型多，變異快，往往導(dǎo)致免疫失敗?；瘜W(xué)合成藥物開發(fā)的風(fēng)險大，并且特異性差，副作用較多。醫(yī)用外源性干擾素、白細(xì)胞介素－2等雖然能抑制病毒復(fù)制，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，但費(fèi)用昂貴，且大量應(yīng)用尚有一定不良反應(yīng)。中藥作為抗病毒藥物具有臨床效果好、毒副作用小、藥源豐富、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)［1，2］。

隨著中藥活性成分現(xiàn)代工藝提取研究的發(fā)展，借助有效的篩選方式，發(fā)現(xiàn)中藥的有效成分，篩選高效單體化合物，并由此開發(fā)出大量新的無污染、低毒性、不良反應(yīng)小、療效確切的抗病毒藥物具有十分重要的意義。本研究初步探尋了中藥黃芪抗新城疫病毒的有效成分的篩選，為開發(fā)新型、有效、環(huán)保的中藥抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪，200～300目硅膠，乙酸乙酯，無水乙醇，甲醇，正己烷，二甲基亞砜均為分析純，市售。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粉碎

使用植物粉碎機(jī)將黃芪粉碎成粉末 （過300目標(biāo)準(zhǔn)篩），后放入樣品袋備用。

1.2.2 浸提濃縮

稱取50.0g粉碎后的中藥粉末放入錐形瓶中，然后在錐形瓶中加入乙酸乙酯和乙醇混合液 （乙酸乙酯∶乙醇＝50∶50）300ml充分混勻，放入60℃的水浴恒溫振蕩器中，振蕩浸提萃取3小時。10000rpm離心10min固液分離，收集上清液作為醇提物。將醇提物在60℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮干燥待用。

1.2.3 藥物組分層析分離

用燒杯量200ml硅膠，用正己烷稀釋混勻，裝柱。將濃縮好的藥物溶解到少量正己烷中，徹底溶解后上樣。正己烷、乙酸乙酯和甲醇按以下比例配成20種溶液作為洗脫液備用，每種200ml。

按以下20個梯度進(jìn)行洗脫：

正己烷∶乙酸乙酯＝90%∶10%；

正己烷∶乙酸乙酯＝80%∶20%；

正己烷∶乙酸乙酯＝70%∶30%；

正己烷∶乙酸乙酯＝60%∶40%；

正己烷∶乙酸乙酯＝50%∶50%；

正己烷∶乙酸乙酯＝40%∶60%；

正己烷∶乙酸乙酯＝30%∶70%；

正己烷∶乙酸乙酯＝20%∶80%；

正己烷∶乙酸乙酯＝10%∶90%；

乙酸乙酯100%；

乙酸乙酯∶甲醇＝90%∶10%；

乙酸乙酯∶甲醇＝80%∶20%；

乙酸乙酯∶甲醇＝70%∶30%；

乙酸乙酯∶甲醇＝60%∶40%；

乙酸乙酯∶甲醇＝50%∶50%；

乙酸乙酯∶甲醇＝40%∶60%；

乙酸乙酯∶甲醇＝30%∶70%；

乙酸乙酯∶甲醇＝20%∶80%；

乙酸乙酯∶甲醇＝10%∶90%；

甲醇100%

每個梯度的洗脫液流速為10ml／min，收集20min［3］。

1.2.4 藥物組分再濃縮

將收集好的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃分別濃縮成約2～5ml的液體，加至稱重的離心管中再用冷凍干燥機(jī)干燥。稱量各離心管的重量，計算各組分收率。標(biāo)注洗脫劑序號，置-20℃冰箱凍存。

1.2.5 黃芪組分抗病毒的篩選試驗(yàn)

1.2.5.1 藥物稀釋

將每種藥物分離組分用二甲基亞砜溶解，根據(jù)各自的濃度分別用維持液稀釋至10－4g／ml（預(yù)試安全濃度），并用預(yù)先處理好的0.22μm的濾器過濾除菌，標(biāo)記號好后備用。

1.2.5.2 接毒與用藥

按照程序?qū)?shù)生長期的Marc145細(xì)胞制備成細(xì)胞懸浮液，加入到96孔板中，每孔100μl，每加6孔混勻一次細(xì)胞瓶，避免細(xì)胞下沉濃度不均勻。細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分為治療組和預(yù)防組。

預(yù)防組細(xì)胞培養(yǎng)20h后，吸去原來的培養(yǎng)液，每孔加入稀釋好的藥物100μl。放培養(yǎng)箱培養(yǎng)8h后，吸去原來孔中的加藥維持液，每孔加入稀釋好的病毒，病毒稀釋濃度依據(jù)病毒滴度試驗(yàn)結(jié)果，參考TCID50給細(xì)胞接毒 （使用稀釋濃度為10－4／0.1ml）每孔20μl。在培養(yǎng)箱中感作1h后，每孔加入200μl維持液。相同每種不同組分設(shè)6個重復(fù)孔，并設(shè)有6個空白對照孔和一個調(diào)零孔。空白對照孔只加維持液，調(diào)零孔不培養(yǎng)細(xì)胞。

治療組細(xì)胞培養(yǎng)28h后，與預(yù)防組同時吸去原來孔中的培養(yǎng)基，每孔加入稀釋好的病毒，接毒劑量和方法與預(yù)防組相同。每種組分設(shè)6個重復(fù)孔，并設(shè)6個空白對照孔和一個調(diào)零孔。空白對照孔只加維持液，調(diào)零孔不培養(yǎng)細(xì)胞。治療組在接毒8h后，吸去原含病毒維持液，加入含治療藥物的維持液100μl繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5.3 測定

預(yù)防組感染后繼續(xù)培養(yǎng)22h，治療組加入治療藥物培養(yǎng)14h后，同時吸去培養(yǎng)孔中的原維持液，加入含MTT染液的維持液 （MTT染液：維持液＝1∶9），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出含染液的維持液，每孔加入150μl二甲基亞砜，振蕩15min后用酶標(biāo)儀在490nm測定OD值。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪預(yù)防組抗病毒篩選試驗(yàn)結(jié)果

黃芪預(yù)防組細(xì)胞培養(yǎng)20h，長成單層細(xì)胞后，更換含藥物的維持液。繼續(xù)培養(yǎng)8h后，細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀態(tài)良好，接種新城疫病毒繼續(xù)培養(yǎng)22h后，觀察細(xì)胞病變，接毒對照組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞聚集、單個細(xì)胞變圓、脫落等現(xiàn)象，1、8、11、12號黃芪提取成分預(yù)防孔細(xì)胞聚集現(xiàn)象明顯，但死亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于接毒對照孔?？瞻讓φ湛准?xì)胞形態(tài)正常。利用MTT染色法測定A490值結(jié)果與細(xì)胞病變觀察結(jié)果相符，由表1可見，1、8、11、12號組預(yù)防孔A490值明顯高于接毒對照組并與其差異極顯著 （P＜0.01）。

表1 黃芪活性成分預(yù)防組抗病毒效果 （A490值，n＝6）

2.2 黃芪治療組抗病毒篩選試驗(yàn)結(jié)果

黃芪治療組細(xì)胞接種新城疫病毒并進(jìn)行給藥治療14h后，觀察細(xì)胞病變，接毒對照組細(xì)胞出現(xiàn)單個細(xì)胞變圓并脫落等現(xiàn)象，1、6、10、12、13號黃芪提取組分治療孔死亡細(xì)胞數(shù)量明顯少于接毒對照孔。空白對照孔細(xì)胞形態(tài)正常。由表2可見，利用MTT染色法測定A490值結(jié)果與細(xì)胞病變觀察結(jié)果相符，1、6、10、12、13號組分治療孔A490值明顯高于接毒對照組，與接毒對照組差異極顯著 （P＜0.01）。

表2 黃芪活性成分治療組抗病毒效果 （A490值，n＝6）

3 討 論

中藥是通過直接殺滅，以及阻斷病毒對正常細(xì)胞的吸附、穿入、復(fù)制等途徑和間接調(diào)節(jié)免疫機(jī)能途徑兩種方式抗病毒的［4，5］。黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)其藥理作用甚廣，除能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)DNA復(fù)制以及RNA和蛋白質(zhì)的合成外，還有固腎降壓、保肝抗炎的功能［6，7］。黃芪能對多種病毒產(chǎn)生干擾、吞噬和結(jié)合等作用以殺滅病毒。胡元亮等研究了黃芪多糖 （APS）在雞胚成纖維細(xì)胞 （CEF）上對雞新城疫病毒 （NDV）感染力的影響，結(jié)果表明，APS對NDV-I和NDV-IV系均有抑制作用，且抑制強(qiáng)度隨APS濃度的升高而增強(qiáng)。另外，APS還具有促進(jìn)機(jī)體對抗病毒，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的能力，一定程度上抑制了病毒的繁殖［8］。謝麟等報道，APS能使動物體誘生內(nèi)源性干擾素，作用于細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白而抑制病毒蛋白的合成，產(chǎn)生抗病毒感染的作用，用于治療雞傳染性法氏囊病和流感等病毒性傳染?。?］。黃芪的另一種主要成分黃芪總苷對病毒性疾病也有很好的效果。鄒宇宏等研究了黃芪總苷 （AST）對乙肝病毒基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)AST能抑制乙肝病毒基因的復(fù)制［10］。美國科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，中藥黃芪含有可有效抑制艾滋病病毒細(xì)胞分裂的化學(xué)物質(zhì)——TAT2，可有效治療艾滋病。

本試驗(yàn)利用藥物篩選模型對黃芪提取成分進(jìn)行抗新城疫病毒活性篩選。結(jié)果顯示，在預(yù)防組中黃芪醇提取物有4種組分對病毒具有抑制作用，1、8、11、12號組分預(yù)防孔的A490值明顯高于接毒對照孔并與其差異極顯著 （P＜0.01）。治療組中黃芪醇提取物中有5種組分抑制效果明顯，1、6、10、12、13號組分治療孔的A490值明顯高于接毒對照孔，與接毒對照組差異極顯著 （P＜0.01），表明上述黃芪醇提取物有顯著抗新城疫病毒活性作用，有助于進(jìn)一步研究其提取物抗病毒活性成分分析。

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