劉海臣

（內(nèi)蒙古民族大學生命科學院，內(nèi)蒙古 通遼 028042）

向日葵屬于菊科一年生草本植物，具有耐鹽堿、抗干早、耐貧瘠等優(yōu)良特性，是植物油脂和蛋白質(zhì)的重要來源，同時，它也是重要的生物能源之一。向日葵很容易受農(nóng)桿菌侵染［1］，所以目的基因很容易通過農(nóng)桿菌進入向日葵的腫瘤細胞。向日葵遺傳工程獲得首例轉(zhuǎn)化植株報道的是利用下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌介導的未知序列基因的轉(zhuǎn)化［2］，并且是用卡那霉素作為再生植株的篩選標記。在向日葵遺傳轉(zhuǎn)化過程中，一些研究表明：利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化向日葵受許多因素影響。這些因素包括外植體的生理年齡［3］、外植體的接種時間［4，5］、農(nóng)桿菌株［6］、共培養(yǎng)時間［3］、培養(yǎng)基中激素種類及濃度［7］、篩選劑的類型及濃度［8，9］和不同的遺傳轉(zhuǎn)化方法［10，11］。

本試驗利用農(nóng)桿菌介導法，研究了共培養(yǎng)時間、侵染時間、重懸液濃度等因素對向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料與轉(zhuǎn)化受體

HA300、NC208、諾雜212三種基因型均由內(nèi)蒙古通遼市種子公司提供，以向日葵下胚軸為轉(zhuǎn)化受體。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株

根癌農(nóng)桿菌EHA101由本實驗室保存，質(zhì)粒 （本室構建）上含有目的基因Psy和植物抗性篩選標記Hpt基因。

1.1.3 向日葵組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基，其成分見表1。

表1 向日葵下胚軸組織培養(yǎng)及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基

1.2 試驗設計

1.2.1 潮霉素適宜篩選濃度試驗

將3個向日葵品種的下胚軸作為外植體，接種到含潮霉素分別為0、5、10、15、20mg／L的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每一梯度每一品種接種外植體數(shù)10，各4次重復。2～3周后調(diào)查下胚軸的分化情況。

1.2.2 影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化因素試驗

實驗中設置共培養(yǎng)時間、侵染時間、農(nóng)桿菌菌液濃度和干燥時間4個因子試驗，共培養(yǎng)時間設置5個處理 （1、2、3、4、5d）；侵染時間設5個梯度 （1、5、10、15、20min）；農(nóng)桿菌菌液濃度A600值分別為0.3、0.6、0.9、1.2；干燥處理時間為0、4、8h，干燥處理方法：將切割好的下胚軸放置在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，在工作臺里放置，讓其自然干燥。以上每一梯度接種外植體數(shù)為48個。

1.2.3 試驗結(jié)果的調(diào)查與數(shù)據(jù)處理

外植體接種到含不同濃度的Hyg培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后調(diào)查下胚軸的芽誘導情況，并統(tǒng)計不定芽率，不定芽率 （%）＝發(fā)生不定芽的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)×100；侵染的外植體在脫菌篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周后，調(diào)查產(chǎn)生抗性芽的外植體數(shù)，計算抗性芽誘導率，抗性芽誘導率 （%）＝抗性芽的外植體數(shù)／侵染的外植體數(shù)×100；抗性芽誘導率用SSPS（13.0版本）軟件進行方差分析與顯著性測驗。

1.3 植物材料的培養(yǎng)

取3個品種向日葵的種子，挑選粒大飽滿的在超凈工作臺上先用75%酒精浸泡1～2min，無菌水沖洗1～2次，然后用無菌水浸泡12h，再用0.1%升汞溶液浸泡10min，用無菌水沖洗3～4次，然后取出向日葵籽仁接種到發(fā)芽培養(yǎng)基上，于25℃、無光照條件下培養(yǎng)。當苗齡2～3d左右時，取無菌苗的下胚軸作為外植體用于轉(zhuǎn)化。

1.4 脫菌篩選培養(yǎng)

共培養(yǎng)3d后，將向日葵下胚軸轉(zhuǎn)移到脫菌篩選培養(yǎng)基上，誘導抗性芽的產(chǎn)生。每天光照16h，溫度25℃，每15～20d天繼代一次，頭孢霉素濃度由300mg／L逐漸降低，以抑制住農(nóng)桿菌的生長為宜。篩選壓Hyg濃度由高到低，10～5mg／L。培養(yǎng)時以未作轉(zhuǎn)化的材料為對照。由于具有Hyg抗性的下胚軸在篩選培養(yǎng)基上能正常生長，并且在下胚軸處分化出綠色芽，而非抗性的小芽逐漸黃化、死亡。

1.5 抗性植株PCR檢測

PCR擴增的引物分別為：引物1：5＇—GAA TTC ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTT GTT—3＇，引物2：5＇—GC GGC CGC TCA TGT TTG GGG TAT CAT AAA AGA—3＇。按王關林的SDS方法提取植物基因組DNA，分別從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對照植株葉片提取DNA作為模板，按94℃預變性3min；94℃變性1min；61℃退火1min；72℃延伸1min。重復30個循環(huán)。最后72℃延伸11min的程序進行PCR擴增，質(zhì)粒為陽性對照，未轉(zhuǎn)化對照植株DNA為陰性對照。PCR反應體系為25μL，模板DNA為1μL。擴增結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選劑潮霉素濃度的確定

從圖1可以看出，3種基因型（HA300、NC208和諾雜212）向日葵下胚軸對潮霉素的敏感性相似，均隨著潮霉素濃度的增加，出芽率呈下降趨勢。無潮霉素時芽的誘導率為68.9%，而當加入不同濃度的潮霉素后對向日葵下胚軸芽的誘導卻有明顯的抑制作用，當潮霉素濃度為15mg／L時，不定芽誘導率降為1.97%，且外植體開始變白、變褐并萎縮。對不同潮霉素濃度和向日葵品種的出芽率進行了方差分析可知，下胚軸出芽率在潮霉素的不同濃度處理間存在極顯著差異 （F＝247.2＞F0.01＝7.01）。10mg／L潮霉素時，下胚軸出芽率極顯著地低于對照，基本上完全抑制不定芽形成。因此，在遺傳轉(zhuǎn)化時，以10mg／L潮霉素作為選擇壓力。

圖1 不同潮霉素濃度對向日葵下胚軸誘導率的影響

2.2 共培養(yǎng)時間對抗性芽率的影響

圖2 共培養(yǎng)時間對向日葵子葉節(jié)抗性芽率的影響

農(nóng)桿菌侵染下胚軸后共培養(yǎng)時間試驗結(jié)果見圖2。由圖2可知，共培養(yǎng)時間對下胚軸抗性芽率的影響存在顯著差異，共培養(yǎng)時間3d的較1d的抗性芽率HA300提高了11.0%、諾雜212提高了7.8%、NC208提高了7.6%，3d的較5d的抗性芽率HA300 高 11.5%、 諾 雜 212 高11.0%、NC208高9.3%，且5個處理以共培養(yǎng)時間3d的抗性芽率最高。因此，確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染后適宜的共培養(yǎng)時間為3d。

2.3 侵染時間對向日葵抗性芽誘導率的影響

在農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化中，菌液的浸染時間對轉(zhuǎn)化有一定的影響。農(nóng)桿菌侵染時間試驗結(jié)果 （圖3）表明，農(nóng)桿菌對HA300、NC208和諾雜212向日葵的下胚軸的侵染時間不同，下胚軸抗性芽率也存在差異，3個品種下胚軸的侵染時間以10min的抗性芽率最高，且顯著地高于1min和20min兩個處理。因此，確定農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時間為10min。

圖3 侵染時間對抗性芽率的影響

2.4 重懸液的濃度對抗性芽的影響

以A600為0.3、0.6、0.9和1.2五種濃度的重懸液分別侵染向日葵HA300、NC208和諾雜212的下胚軸，5周之后調(diào)查抗性芽率 （圖4）。由圖4可知，當菌液濃度達到0.6時，抗性芽率最高，隨著重懸液濃度的增加抗性芽率而減少。對不同重懸液濃度進行方差分析結(jié)果表明，不同重懸液間的抗性芽率存在極顯著差異 （F＝12.53＞F0.01＝4.76），但重懸液濃度A600為0.6和0.9之間的下胚軸抗性芽率差異不顯著。在試驗中還發(fā)現(xiàn)，當重懸液濃度增加時，雖然侵染機率很大，但是下一步抑菌工作帶來很大困難，而且對植物細胞的傷害也很大，導致相當一部分細胞褐化、失去再生能力或死亡。因此我們選擇A600為0.6為侵染時所用重懸液濃度。

2.5 外植體干燥處理對抗性芽率的影響

細胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果，研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細胞的滲透壓，來提高轉(zhuǎn)化效率。但通過對外植體干燥處理還未見報道。本試驗對侵染的向日葵下胚軸進行了4h和8h的干燥處理（圖5）。由圖5可知，向日葵品種HA300和NC208下胚軸4h干燥處理的抗性芽率，較不處理分別提高11.8%和19.6%，較8h處理分別高6.7%和10.7%，說明對預侵染的下胚軸進行適當?shù)母稍锾幚碛兄诳剐匝柯实奶岣摺?/p>

圖4 農(nóng)桿菌重懸菌液濃度對抗性芽率的影響

2.6 抗性苗的PCR檢測

從抗性植株和未轉(zhuǎn)化對照植株葉片提取總DNA作為模板進行PCR擴增，未轉(zhuǎn)化苗為陰性對照，質(zhì)粒為陽性對照，以λDNA／EcoRⅠ＋HindⅢ 雙酶切DNA分子為標準分子量，電泳結(jié)果見圖6。圖6表明，轉(zhuǎn)基因苗和質(zhì)粒都在1.3kb附近擴增出特異條帶，而陰性對照苗卻未擴增出相應的特異條帶，由此初步證實，目的基因Psy已轉(zhuǎn)入到向日葵中。本試驗共獲得向日葵抗性苗126株，經(jīng)PCR檢測得到4株轉(zhuǎn)基因向日葵苗，轉(zhuǎn)化率為3.2%。NC208得到1株，HA300得到3株，諾雜212未得到轉(zhuǎn)化株。

圖5 干燥時間對向日葵下胚軸抗性芽率的影響

3 討 論

3.1 篩選劑對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

遺傳轉(zhuǎn)化過程中，重要的一個環(huán)節(jié)是受體的抗性篩選。通過篩選那些未轉(zhuǎn)化的受體就會死亡，而已轉(zhuǎn)化的受體因有抗性而存活下來。一般的做法是，在繼代時去掉褐化或死亡的外植體，但我們在向日葵下胚軸抗性篩選時發(fā)現(xiàn)，抗性芽不但從綠色的愈傷組織上長出芽，而且會從褐化非常嚴重、看上去死亡的愈傷組織上長出，而這些芽很有可能發(fā)育成抗性的苗。這可能是由于轉(zhuǎn)化首先是對細胞的轉(zhuǎn)化，而不是組織；表現(xiàn)褐化的愈傷組織，是大多數(shù)的細胞死亡了，而個別抗性細胞仍還活著，只是被大量的褐化細胞包圍而難于生長。一旦去掉篩選劑，這些抗性細胞便進行生長發(fā)育，進而分化成苗。因此，褐化的下胚軸不要過早地丟棄。本實驗研究結(jié)果表明，不同的基因型對潮霉素的敏感性確實存在差別，潮霉素使用濃度為10mg／L最佳。此外，潮霉素的使用方式如篩選壓濃度宜由低到高還是由高到低，仍需進一步探索。

圖6 向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化的PCR檢測

3.2 共培養(yǎng)時間與侵染時間對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

向日葵下胚軸作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體，由于下胚軸是器官組織，且表面積較小，農(nóng)桿菌侵染時不易接觸到傷口細胞。因此，所需的侵染時間比其它組織，如愈傷、體細胞胚組織等要長。在本試驗確定10min為農(nóng)桿菌侵染下胚軸的較適宜時間。

農(nóng)桿菌對植物進行轉(zhuǎn)化時，必須在傷口部位存活16h以上，才能進行T－DNA的轉(zhuǎn)移。此期間涉及農(nóng)桿菌向受傷部位的附著，Vir區(qū)基因的誘導活化及T－DNA的轉(zhuǎn)移整合。因此，需要較長的共培養(yǎng)時間，但在實際操作中，共培養(yǎng)時間也不宜太長，如果共培養(yǎng)時間太長，農(nóng)桿菌過度生長，不僅造成脫菌困難，還會使下胚軸受到毒害，不定芽形成困難或褐化死亡。本試驗確定向日葵下胚軸農(nóng)桿菌侵染的共培養(yǎng)時間為3d。

3.3 外植體干燥處理對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的影響

細胞滲透壓的改變可以影響轉(zhuǎn)化效果，研究者通過添加甘露醇或山梨醇來改變植物細胞的滲透壓，來提高轉(zhuǎn)化效率。本研究試圖通過對下胚軸干燥處理來改變細胞的滲透壓，進而提高抗性芽率。試驗表明，對下胚軸進行適當?shù)母稍锾幚碛欣诳剐匝柯实奶岣?。以干燥處?h的下胚軸為外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化，下胚軸抗性芽率較不處理有明顯的提高。

4 小 結(jié)

建立了農(nóng)桿菌介導的向日葵下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系，適宜的菌液濃度A600為0.6、侵染時間為10min、共培養(yǎng)時間為3d、篩選劑潮霉素的濃度為10mg／L，下胚軸干燥處理時間4h有利于向日葵的遺傳轉(zhuǎn)化。

［1］Braun A C.Development of secondary tumors strands in the crown gall of sunflower［J］.Phytopathology，1941，31：135-149.

［2］Everett N P，Robinson K E P，Mascarenhas D.Genetic engineering of sunflower（Helianthus annuus L.）［J］.Biotechnology，5：1987，1201-1204.

［3］Schrammeijer B，Sijmons P C，van den Elzen P J M，et al.Meristem transformation of sunflower via Agrobacterium［J］.Plant Cell Rep，1990，9：55-60.

［4］Knittel N，Gruger V，Hahne G，et al.Transformation of sunflower（Helianthus annuus L.）：A reliable protocol［J］.Plant Cell Rep，1994，14：81-86.

［5］Grayburn W S，Vick B A.Transformation of sunflower（Helianthus annuus L.）following wounding with glass beads［J］.Plant Cell Rep，1995，14：285-289.

［6］Bidney D，Scelonge C，Martich J，et al.Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Mol Biol，1992，18：301-313.

［7］Burrus M，Rousselin P，Knittel N，et al.Transformation of sunflower：an overview of different approaches，their difficulties，how to overcome them，and first results［A］.Proceeding 14th International Sunflower Conference［C］.Beijing／Shenyang：Sunflower Association，1996：1064-1068.

［8］Escandón AS，Hahne G.Genotype and composition of culture medium are factors important for transformed sunflower（Helianthus annuus L）callus［J］.Physiol Plant，1991，1：367-376.

［9］Pugliesi C，Biasini M G，F(xiàn)ambrini M，et al.Genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens in the interspecific hybrid Helianthus annuus x Helianthus tuberosus［J］.Plant Sci，1993，93：105-115.

［10］Moyne A L，Tagu D，Thor V，et al.Transformation calli obtained by direct gene transfer into sunflower protoplast［J］.Plant Cell Rep，1989，8：97-100.

［11］Laparra H，Burrus M，Huonold R，et al.Expression of foreign genes in sunflower（Helianthus annuus L.）evaluation of three gene transfer methods［J］.Euphytica，1995，85：63-74.