張艷梅， 康經(jīng)武

(中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032）

由于具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和良好的類藥性質(zhì)，天然產(chǎn)物一直是發(fā)現(xiàn)新藥的重要資源［1－3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1981年到2010年間，全球新發(fā)現(xiàn)的1073個(gè)小分子藥物中，有64%來(lái)自天然產(chǎn)物或者天然產(chǎn)物衍生物［4］。在治療癌癥和傳染病方面的新藥中分別有60%和75%的新藥源于天然產(chǎn)物以及衍生物［4－6］。

傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物活性成分研究的方法是先分離純化，再進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和活性測(cè)試。這樣的方法耗時(shí)費(fèi)力，分離純化過(guò)程常常需要幾個(gè)月之久，也容易丟失具有活性的微量成分。近年來(lái)，開(kāi)始采用活性追蹤分離(bioassay-guided fractionation）策略，將活性測(cè)試貫穿于分離過(guò)程中，只分離有活性的組分，這樣就可以減少不必要的工作量。然而分離純化技術(shù)仍難與高通量篩選技術(shù)相匹配，這大大減慢了從天然產(chǎn)物中篩選活性成分的速度［3，7］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近20年來(lái)全球獲得批準(zhǔn)上市的天然產(chǎn)物類藥物有逐漸減少的趨勢(shì)［4］。因此，非常有必要充分利用高效液相色譜(HPLC）技術(shù)，結(jié)合微量的活性測(cè)試技術(shù)，發(fā)展能夠?qū)崿F(xiàn)高通量分離純化、結(jié)構(gòu)確證和活性篩選的天然產(chǎn)物活性成分研究的新技術(shù)。

HPLC與質(zhì)譜(MS）的聯(lián)用技術(shù)使得復(fù)雜成分的分析更為快捷，已經(jīng)成為藥物研究的重要工具之一［8－10］。毛細(xì)管電泳(CE）作為繼 HPLC 之后又一強(qiáng)有力的分離分析方法，不僅具有高的分離效能和靈活多樣的分離方式，而且也能成為藥物篩選多樣化的平臺(tái)［11］。毛細(xì)管電泳介導(dǎo)的酶微反應(yīng)器技術(shù)(EMMA）［12－14］實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)和檢測(cè)的一體化，試劑消耗量為納升級(jí)，反應(yīng)分離速度快，自動(dòng)化程度高，可以不受復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾，非常適合用于天然產(chǎn)物粗提物中活性成分的篩選［15－19］。

本文中我們報(bào)道一種將毛細(xì)管電泳活性測(cè)試與高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS）分離純化相結(jié)合，應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分篩選的研究。CE可以作為微量的活性測(cè)試平臺(tái)，而HPLC可以作為高效的天然產(chǎn)物分離純化工具。本文選擇乙酰膽堿酯酶(ACHE）和對(duì)ACHE有抑制作用的黃連粗提物［18］為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yàn)證所發(fā)展的篩選體系。利用半制備HPLC將黃連粗提物中的成分分離純化，再用EMMA對(duì)分離得到的微克級(jí)組分進(jìn)行活性測(cè)試，用二級(jí)質(zhì)譜確定活性成分的結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的篩選方法相比，我們發(fā)展的方法集成了分離純化和活性篩選，這將大大縮短篩選天然產(chǎn)物中活性成分的時(shí)間，同時(shí)也能夠用于中藥有效成分的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent毛細(xì)管電泳儀，Agilent 1260液相色譜儀(Waldbron，德國(guó)），LCQ Fleet離子阱質(zhì)譜儀(Thermo Scientific，美國(guó)），Millipore-Simplicity UV超純水系統(tǒng)(Millipore，MA，美國(guó)）。熔融石英毛細(xì)管(SGE Analytical Science，澳大利亞），50 μm i.d.，370 μm o.d.，柱長(zhǎng) 34.5 cm，有效長(zhǎng)度 26 cm。

乙酰膽堿酯酶、鹽酸硫代乙酰膽堿(AThCh）購(gòu)自Sigma-Aldrich，小檗堿(berberine）、藥根堿(jatrorrhizine）、黃連堿(coptisine）、巴馬汀(palmatine）購(gòu)自阿拉丁，木蘭花堿(magnoflorine）、表小檗堿(epiberberine）、非洲防己堿(columbamine）、甲基黃連堿(worenine）購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，異丙醇、四硼酸鈉和β-環(huán)糊精均為AR級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，乙腈(HPLC級(jí)）購(gòu)自 Merck，甲酸(HPLC級(jí)）購(gòu)自TEDIA，黃連飲片購(gòu)自上海雷允上藥店。

1.2 樣品配制

黃連粗提物的制備:取10 g黃連飲片，磨成細(xì)粉，加入50 mL 70%(v/v）乙醇超聲提取3次，每次45 min，所得提取液經(jīng)抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，然后抽真空干燥待用。用于分離純化的黃連粗提物溶液的配制:稱取黃連粗提物30 mg，加入3 mL含50%(v/v）異丙醇的水溶液配制成為10 g/L的溶液，渦旋混合，超聲溶解2 min，以12000 r/min離心3 min。用于活性測(cè)試的溶液的配制:黃連粗提物、各種標(biāo)準(zhǔn)品、半制備色譜柱純化的組分用50%(v/v）異丙醇水溶液溶解并用水配成質(zhì)量濃度為0.25 g/L的溶液。

其他溶液由Millipore純化系統(tǒng)凈化的超純水配制，所有緩沖溶液使用前需用0.45 μm濾膜過(guò)濾。所有溶液使用時(shí)均需新鮮配制。

1.3 黃連粗提物的HPLC分析條件及質(zhì)譜條件

分析色譜柱為Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A相為10 mmol/L甲酸銨(含0.1%(v/v，下同）甲酸）水溶液，B相為乙腈(含0.1%甲酸）。采用30 min梯度洗脫:0～6 min，5%B ～20%B;6～25 min，20%B ～30%B;25～30 min，30%B～100%B;流速為1 mL/min。黃連粗提物的質(zhì)量濃度為1 g/L;檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。

電噴霧電離正離子模式，噴霧電壓為4.5 kV，鞘氣流速12 L/min，輔助氣流速1.5 L/min，金屬毛細(xì)管溫度為320℃，金屬毛細(xì)管電壓為35 V，二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量為36 V。

1.4 黃連粗提物分離純化的色譜條件

半制備色譜柱為Thermo Scientific ODS-C18(250 mm×10 mm，5 μm）;流動(dòng)相 A相為H2O(含0.1%甲酸），B相為乙腈 (含0.1%甲酸）。采用20 min梯度洗脫:0～20 min，25%B～32%B;流速為3.5 mL/min。黃連粗提物的質(zhì)量濃度為10 g/L;檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，進(jìn)樣體積為50 μL。

1.5 黃連粗提物中活性成分篩選的實(shí)驗(yàn)步驟和電泳條件

新毛細(xì)管柱用0.1 mol/L NaOH溶液處理30 min，再分別用去離子水、30 mmol/L硼砂緩沖溶液沖洗5 min。每次上樣分析前用1 mol/L NaCl、0.1 mol/L NaOH、去離子水、緩沖液沖洗3 min。本文中乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選的實(shí)驗(yàn)步驟如圖1所示:(1）將0.4 g/L ACHE和底物AThCh(含或不含抑制劑）溶液分別以2000 Pa×4 s的壓力依次導(dǎo)入毛細(xì)管進(jìn)樣端。在每次進(jìn)樣前設(shè)定進(jìn)樣程序，使毛細(xì)管柱進(jìn)口端浸入盛有去離子水的樣品瓶中5 s以防止樣品之間的污染。(2）在毛細(xì)管兩端加上1 kV×15 s的電壓使酶溶液和底物溶液區(qū)帶充分混合。(3）在毛細(xì)管兩端加上15 kV的電壓將未反應(yīng)底物和產(chǎn)物在線分離，通過(guò)紫外檢測(cè)可直接測(cè)定產(chǎn)物巰基膽堿(TCh）的面積，即可以表征酶的活性。對(duì)于抑制劑的篩選，在底物溶液中加入一定量的待篩選化合物，通過(guò)產(chǎn)物TCh峰面積的減小來(lái)判定待篩選化合物是否具有抑制酶活性的作用。

圖1 (a）電泳介導(dǎo)的酶微反應(yīng)器(EMMA）測(cè)試ACHE活性的示意圖和(b）ACHE催化水解AThCh的反應(yīng)方程式Fig.1 (a）Schematic illustration of EMMA procedure for ACHE activity assay and(b）ACHE catalyzed reaction

經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的電泳條件為:毛細(xì)管總長(zhǎng)為34.5 cm，有效長(zhǎng)度為26 cm，柱內(nèi)徑為50 μm;緩沖溶液為 30 mmol/L 硼砂(pH=8.00），含 15 mmol/L β-環(huán)糊精;進(jìn)樣2000 Pa×4 s;分離電壓為15 kV;柱溫37℃;檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm;酶質(zhì)量濃度0.4 g/L;硫代乙酰膽堿濃度為10 mmol/L(含20 mmol/L硫酸鎂）;混合時(shí)間15 s;孵育時(shí)間0 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃連粗提物成分的HPLC分析及半制備分離條件的建立

本文采用HPLC-MS對(duì)黃連粗提物溶液(1 g/L）進(jìn)行分析，通過(guò)改變流動(dòng)相中甲酸的含量，緩沖鹽的類型(乙酸銨、甲酸銨）及其濃度，最終確定用于HPLC分析的最佳流動(dòng)相組成為10 mmol/L甲酸銨水溶液-乙腈(各含0.1%甲酸）。UV檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，質(zhì)譜檢測(cè)采用正離子模式。所得到的色譜圖和總離子流圖見(jiàn)圖2。黃連粗提物中的主要成分是異喹啉生物堿。我們得到的黃連粗提物的HPLC-MS/MS色譜圖有13個(gè)峰，其中8個(gè)主要峰經(jīng)質(zhì)譜鑒定，分別是木蘭花堿(峰3）、藥根堿(峰6）、表小檗堿(峰7）、非洲防己堿(峰8）、黃連堿(峰9）、甲基黃連堿(峰10）、巴馬汀(峰11）、小檗堿(峰12），它們的結(jié)構(gòu)式如圖3。

圖2 黃連粗提物的HPLC分析Fig.2 HPLC analysis of Rhizoma coptidis extract

圖3 黃連粗提物中部分生物堿的結(jié)構(gòu)式及對(duì)ACHE的IC50值Fig.3 Structures of some alkaloids of Rhizoma coptidis extract and IC50values for ACHE inhibition

由于使用半制備HPLC對(duì)黃連粗提物進(jìn)行分析時(shí)，進(jìn)樣量增加，因此除了圖2中經(jīng)質(zhì)譜鑒定的8個(gè)峰之外(其中7和8號(hào)峰重疊在一起，視為一個(gè)組分），其他5個(gè)峰的紫外響應(yīng)信號(hào)得到增強(qiáng)，其色譜分離如圖4a所示。

圖4 黃連粗提物的(a）半制備色譜分離圖及(b）分離制備的13個(gè)組分對(duì)ACHE的抑制率Fig.4 (a）Chromatogram of semipreparative HPLC analysis of Rhizoma coptidis extract and(b）inhibition rates of thirteen fractions of Rhizoma coptidis extract on ACHE

采用本課題組發(fā)展的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選方法［18］對(duì)黃連粗提物及HPLC分離制備的化合物進(jìn)行活性測(cè)試，其電泳分離圖如圖5所示，從圖5中可明顯看出底物AThCh、抑制劑和產(chǎn)物TCh都達(dá)到了基線分離，并且當(dāng)篩選樣品底物溶液中加有黃連粗提物時(shí)，其產(chǎn)物峰面積與空白相比明顯降低。將分離純化的每個(gè)組分用真空離心干燥儀干燥后，用50%(v/v）異丙醇水溶液重新溶解，用EMMA分別測(cè)定各組分對(duì)ACHE的抑制作用，各個(gè)組分的抑制作用百分比如圖4b所示。結(jié)果表明，在各組分質(zhì)量濃度為0.25 g/L下，除了組分1、2、3對(duì)ACHE的活性沒(méi)有抑制作用外，其余的9個(gè)組分均有不同程度的抑制作用，其抑制作用由強(qiáng)到弱排序?yàn)?組分12＞11＞7+8＞6＞10≈ 9≈ 5＞13＞4。

圖5 ACHE抑制劑篩選的電泳分離圖Fig.5 Electropherograms for screening the ACHE inhibitor

2.2 活性化合物組分的驗(yàn)證

我們用8個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行活性測(cè)試驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)除了木蘭花堿沒(méi)有抑制作用以外，其余的7種化合物均有抑制作用，這個(gè)結(jié)果與黃連粗提物分離制備的組分的抑制作用相吻合。我們測(cè)得的這7種化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制曲線如圖6所示，測(cè)得這7種化合物的IC50值見(jiàn)圖3。

結(jié)果顯示，木蘭花堿這種非小檗堿型生物堿對(duì)ACHE沒(méi)有抑制作用。7種小檗堿型生物堿的2、3、9、10、13位有著不同的取代基(見(jiàn)圖3），其取代基可能為-OH、-OCH3、-OCH2O-、-CH3。通過(guò)對(duì)比各化合物的IC50值可知，不同的取代基將會(huì)影響化合物的抑制活性。

圖6 黃連粗提物中7種生物堿對(duì)ACHE的抑制曲線Fig.6 Inhibition curves of ACHE in the presence of seven alkaloids

比較小檗堿和巴馬汀以及表小檗堿和黃連堿，前者的抑制作用為后者的3倍多以及2倍多，之所以抑制作用有如此大的差異，主要是因?yàn)镽2、R3不同，表明R2、R3處的-OCH2O-對(duì)抑制作用有著增強(qiáng)的作用。當(dāng)巴馬汀的R3或R2取代基的-OCH3變?yōu)?OH時(shí)，化合物相應(yīng)變?yōu)樗幐鶋A、非洲防己堿，其抑制作用有所增強(qiáng)，表明了 R2、R3處的-OH對(duì)ACHE的抑制作用也有增強(qiáng)的作用。R9、R10對(duì)ACHE的抑制作用同樣具有重大的影響。當(dāng)巴馬汀的 R9、R10處的-OCH3變?yōu)?OCH2O-，其對(duì) ACHE 的抑制作用降低至不足原來(lái)的1/8;當(dāng)小檗堿的R9、R10處的-OCH3變?yōu)?OCH2O-，其對(duì)ACHE的抑制作用降低至不足原來(lái)的1/11，這一結(jié)果表明R9、R10處的-OCH3對(duì)ACHE的抑制作用有著增強(qiáng)作用。R13同樣影響對(duì)ACHE的抑制作用，當(dāng)黃連堿的R13變?yōu)?CH3，其抑制作用降低至不足原來(lái)的1/2，這一結(jié)果表明R13處的-CH3對(duì)ACHE的抑制作用有減弱效果?？傊?，所得到的結(jié)果表明了木蘭花堿、表小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿沒(méi)有或者具有較弱的抑制作用，而藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀、小檗堿具有較強(qiáng)的抑制作用。

3 結(jié)論

本文建立了CE的活性測(cè)試與HPLC-MS的快速分離相結(jié)合的技術(shù)用于篩選天然產(chǎn)物活性成分，可以實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物活性成分的分離純化、活性測(cè)試和結(jié)構(gòu)鑒定。HPLC-MS具有較高的分離效能，每次分離制備僅需20 min;CE可以較快地進(jìn)行活性測(cè)試，每次分離僅需2.5 min。納升級(jí)的酶用量使篩選成本顯著降低，納升級(jí)的待篩化合物用量減輕了對(duì)天然產(chǎn)物分離制備的工作量。將分離純化-活性篩選相結(jié)合，可以適用于復(fù)雜樣品，可以高效、有選擇性地對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行活性成分的篩選和結(jié)構(gòu)鑒定。本工作建立的CE/HPLC-MS篩選體系為高通量快速篩選、尋找先導(dǎo)化合物以及開(kāi)發(fā)新藥提供了新技術(shù)。

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