余欣尉， 吳 謙， 呂 望， 王 彥， 馬小瓊， 陳 喆*， 閻 超*

(1.上海交通大學藥學院，上海 200240;2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室，浙江杭州 310006）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，每年全球有上百萬人死于肺癌。肺癌原位癌治愈率接近100%，但由于肺癌早期臨床表現(xiàn)不明顯，大部分患者確診時已屬晚期，只能采用姑息治療，預(yù)后較差，總的5年生存率約10%～15%［1］，因此，發(fā)展有效的早期診斷方法無疑能使患者盡早得到治療，明顯改善患者預(yù)后，延長肺癌患者的生存時間。目前肺癌診斷的常用方法有影像學檢查方法、痰脫落細胞學檢查和支氣管鏡檢技術(shù)［2］，這些方法容易造成漏診與誤診，且儀器價格昂貴，不適合作為肺癌早期篩查手段。

近年來，隨著系統(tǒng)生物學的飛速發(fā)展，腫瘤標志物的識別已成為惡性腫瘤早期診斷的研究熱點。腫瘤標志物是指在腫瘤發(fā)生和增生過程中，由腫瘤細胞生物合成、釋放或者是腫瘤與宿主相互作用而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，其最終導(dǎo)致體內(nèi)的代謝物質(zhì)發(fā)生變化［3］。代謝組學可以對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的所有代謝物進行定性和定量分析，并能識別未知代謝產(chǎn)物［4］。這種方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于乳腺癌［5］、前列腺癌［6］的腫瘤標志物識別中，對建立肺癌的早期診斷方法具有重要的參考價值。

目前肺癌早期標志物的代謝組學研究主要通過對比肺癌病人與健康人的血液或尿液，但在很多代謝過程中，代謝產(chǎn)物個體差異大，極易受到飲食、環(huán)境、年齡和其他疾病等因素的干擾，在如此復(fù)雜的背景下識別疾病標志物極有難度。而以腫瘤細胞作為代謝組學研究對象，通過細胞代謝物的差異表達尋找潛在的特異性疾病標記物，可以避免常規(guī)實驗中樣本個體差異與復(fù)雜性問題，是一種極有前景的技術(shù)方法。Sheikh等［7］考察了細胞培養(yǎng)與提取方法對代謝物的影響，Gao等［8］考察了細胞脂質(zhì)代謝物的提取方法和條件，這些研究都為開展細胞代謝組學研究提供了基礎(chǔ)，但相關(guān)研究國內(nèi)外尚無報道。

本課題組以肺癌與對照細胞為樣本，采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)結(jié)合代謝組學數(shù)據(jù)處理手段，探索新的研究思路以識別疾病標志物，同時與傳統(tǒng)肺癌代謝組學研究結(jié)果相互驗證，為肺癌的早期診斷提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Paradigm MG4高效液相色譜儀(美國Michrom公司）;maXis UHR-TOF超高分辨四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(德國Bruker公司）;IEC MICROCL 17R微量冷凍高速離心機(美國Thermo公司）;VXR旋渦混合器(德國IKA公司）;離心濃縮干燥器(太倉市華美生化儀器廠）;25 cm2斜頸細胞培養(yǎng)瓶(美國BD Falcon公司）。

胎牛血清、McCoy's 5A培養(yǎng)液、DMEM(Dulbecco's modified eagle medium）高糖培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司）;甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck公司）;甲酸、醋酸銨(LC-MS級，瑞士 Fluka公司）;去離子水由 NANOpure超純水系統(tǒng)(美國Barnstead公司）制備。

1.2 細胞來源

人肺癌細胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9和人正常胚肺成纖維細胞MRC-5均購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 細胞培養(yǎng)

取Calu-1細胞使其貼壁生長于含10%(體積分數(shù)，下同）胎牛血清的 McCoy's 5A培養(yǎng)液中;取MRC-5細胞使其貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中;取 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、PC-9使其貼壁生長于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中;所有細胞均培養(yǎng)于25 cm2斜頸細胞培養(yǎng)瓶中。將所有培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種細胞平行培養(yǎng)6份，其中1份用于細胞計數(shù)，另外5份用于細胞提取。

1.4 細胞提取方法

取一盒對數(shù)生長期的細胞，倒掉培養(yǎng)基，用10 mL冰磷酸鹽緩沖液(PBS）清洗兩遍，液氮淬滅。在每盒細胞中加入0.75 mL甲醇-水(4∶1，v/v）溶液，用細胞刮刀刮下細胞，置于1.5 mL離心管中。在液氮、37℃水浴中反復(fù)凍融兩次。加入3 μL 100 μg/mL L-2-氯苯丙氨酸(內(nèi)標）與 3 μL 100 μg/mL溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine，LPC）12:0，加入0.45 mL二氯甲烷。置冰上，每5 min短暫渦旋一次，每次渦旋30 s，持續(xù)30 min。加入0.15 mL水促進分層。在4℃下12000 r/min離心5 min，置于-20℃冰箱中過夜。將離心管上層與下層分別轉(zhuǎn)移至兩個新離心管中，旋干，上層用60 μL含0.1%甲酸的水溶液復(fù)溶，下層用60 μL含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸(74∶25∶1，v/v/v）溶液復(fù)溶。分別進樣分析。

1.5 上層提取物的色譜條件

C18 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，日本Shisedo公司）;流動相A:含0.1%甲酸的水溶液，流動相 B:含 0.1%甲酸的乙腈溶液;流速:200 μL/min。梯度洗脫程序:0～5 min 0%B，5～25 min 0～50%B，25～30 min 100%B;柱溫:25℃;進樣量:20 μL。

1.6 下層提取物的色譜條件

C18 色譜柱(100 mm ×2.1 mm，3 μm，日本Shiseido公司）;流動相A:含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸(74∶25∶1，v/v/v）;流動相 B:含 5 mmol/L醋酸銨的甲醇-甲酸(99∶1，v/v）;梯度洗脫程序:0～10 min 50%B～100%B，10～30 min 100%B;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。

1.7 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI）正離子模式檢測，噴霧電壓:+4.5 kV;霧化氣壓:80 kPa;干燥氣流速:6.0 L/min;干燥氣溫度:200℃;碰撞池電壓(RF）:500 Vpp;質(zhì)量掃描范圍:m/z 50～1000;質(zhì)量校正液:1 mmol/L甲酸鈉。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將HPLC-MS獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Bruker DataAnalysis 3.3軟件轉(zhuǎn)換成 NetCDF格式，導(dǎo)入metAlignTM軟件包進行峰識別、峰對齊、基線矯正和峰面積歸一化法預(yù)處理。然后導(dǎo)入SIMCAP 11.5軟件進行多維統(tǒng)計分析，在本實驗中采用PLS-DA模型區(qū)別各組代謝物差異，通過 R2X、R2Y、Q2參數(shù)值評價模型質(zhì)量，其中R2X、R2Y越接近1表示模型越穩(wěn)定，Q2＞0.5表示預(yù)測率高。根據(jù)PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值(VIP）找到潛在的疾病生物標志物，其中VIP＞1。為了驗證多維統(tǒng)計中找到的差異物是否在單位統(tǒng)計上具有顯著差別，實驗中采用 T檢驗，其中 p＜0.05有顯著性差異［9］。通過差異物的精確質(zhì)荷比及同位素比例，在 HMDB(http://www.hmdb.ca/）和 METLIN(http://metlin.scripps.edu/）數(shù)據(jù)庫中搜索可能的結(jié)構(gòu)式進行推測。

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞提取方法的優(yōu)化

液液萃取是代謝物提取方法中常用的方法之一，Sana等［10］以血紅細胞為研究對象，系統(tǒng)考察了液液萃取過程中有機相和水相的性質(zhì)、兩相溶劑比例、水相pH等因素對提取到的化合物數(shù)量和實驗方法重現(xiàn)性的影響。Lorenz等［11］詳細考察了不同的淬滅方法、清洗溶劑、提取溶劑對INS-1細胞代謝物的提取效率與穩(wěn)定性的影響。本實驗對文獻所述的樣品前處理方法進行了優(yōu)化，采用液液萃取的方法，分別提取細胞極性代謝物與非極性代謝物。實驗表明，用PBS進行清洗，液氮淬滅有助于穩(wěn)定樣品代謝物。樣品在液氮及37℃水浴中反復(fù)凍融兩次，細胞可完全破碎。以甲醇-水-二氯甲烷(4∶2∶3，v/v/v）作為提取液，水相和有機相的互溶性最小，得到的細胞代謝物數(shù)量最多。此外，本實驗中以二氯甲烷代替文獻中常用的氯仿，減少了萃取溶劑對實驗人員與環(huán)境的危害。

2.2 分析條件的優(yōu)化

實驗中考察了流動相性質(zhì)與洗脫梯度對樣品分離效果的影響。

細胞上層提取物主要為極性代謝物，適合使用含0.1%甲酸的乙腈-水流動相體系。同時，比較了不同梯度(27 min、37 min、47 min）下的色譜分離情況，實驗表明，采用1.5節(jié)所述的梯度條件對細胞極性代謝物樣品的分析速度適中，分離效果最佳。

細胞下層提取物主要為脂質(zhì)等非極性代謝物，這些物質(zhì)在色譜柱中的保留時間較長，且難以洗脫。實驗中考察了含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸體系流動相與含10 mmol/L醋酸銨的甲醇-水-甲酸體系流動相對脂質(zhì)的洗脫能力，同時比較了不同梯度(27、37、47 min）下的色譜分離情況，實驗表明，5 mmol/L醋酸銨流動相體系下質(zhì)譜信號基線穩(wěn)定，峰形較好，采用1.6節(jié)所述的梯度條件能檢測到的色譜峰個數(shù)最多。

在最優(yōu)HPLC-MS分析條件下，分別對人肺癌細胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人胚肺成纖維細胞MRC-5的極性代謝物與非極性代謝物進行分析，得到不同細胞的代謝物指紋圖譜。在S/N=10時，8種細胞的極性代謝物譜圖分子特征峰個數(shù)在4000～6000之間，非極性代謝物譜圖分子特征峰個數(shù)比較接近，在2400～2600之間。較大的色譜峰容量為細胞代謝物的分析提供了豐富信息。圖1為典型的細胞極性和非極性代謝物譜圖。

圖1 H358細胞的(a）極性、(b）非極性代謝物譜圖Fig.1 Typical HPLC-MS base peak chromatograms of(a）polar metabolite profile and(b）non-polar metabolite profile of lung tumor cell H358

實驗中以內(nèi)標物質(zhì)L-2-氯苯丙氨酸與保留時間為 6.46、7.70、10.30、26.32 min 的 5 個主要色譜峰的保留時間考察了極性代謝物層實驗方法的重現(xiàn)性，譜峰保留時間的RSD均小于1.37%;同時以內(nèi)標物質(zhì) LPC 12:0 與保留時間為 11.49、16.31、20.11、24.23 min的5個主要色譜峰的保留時間考察了非極性代謝物層實驗方法的重現(xiàn)性，譜峰保留時間的RSD均小于1.04%，表明實驗所用方法具有較好的重現(xiàn)性。在優(yōu)化的色譜條件下，系統(tǒng)對標準品L-2-氯苯丙氨酸和LPC 12:0的檢出限均為0.5 ng/mL。

實驗中還考察了同一樣品在正、負離子兩種模式下的出峰情況，發(fā)現(xiàn)細胞樣品在正離子模式下的色譜峰較多，獲得的信息量更多，且信號強度較大，因此選擇正離子模式對細胞代謝物進行分析。

2.3 PLS-DA模型結(jié)果

在上述色譜條件下，分別對8種細胞的極性與非極性代謝物進樣分析，采用PLS-DA模型進行多維統(tǒng)計分析［11］。圖2分別為8種細胞的極性代謝物與非極性代謝物的PLS-DA得分圖。對于極性代謝物，該模型包含5個主成分，其擬合參數(shù)為R2X=0.779，R2Y=0.98，Q2=0.954;對于非極性代謝物，該模型包含3個主成分，其擬合參數(shù)為R2X=0.481，R2Y=0.983，Q2=0.974;說明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測率較高。

由圖2可見，在極性代謝物層與非極性代謝物層，人胚肺成纖維細胞MRC-5均與其他7種人肺癌細胞相距較遠，說明非腫瘤細胞與腫瘤細胞代謝物有著顯著差異。在極性代謝物層，MRC-5細胞相對比較分散，其他各種腫瘤細胞組內(nèi)聚類較好，這可能是由于人胚肺細胞分化程度低，而腫瘤細胞分化程度高，這與栗暉等［12］的研究結(jié)果一致。從圖2中還可以看出，無論是在極性代謝物層還是在非極性代謝物層，7種人肺癌細胞的代謝物之間也存在細微的差異，這種差異可能是由于各細胞不同的組織來源、形態(tài)和治療背景造成的。

2.4 代謝差異物

通過HMDB和METLIN數(shù)據(jù)庫搜索差異物的精確質(zhì)荷比，對一些具有顯著性差異的物質(zhì)進行了初步的結(jié)構(gòu)鑒別，獲得了10種細胞極性代謝差異物(見表1）與21種細胞非極性代謝差異物結(jié)構(gòu)信息(見表2）。

在腫瘤細胞的極性代謝物層，苯丙氨酸含量增加，纈氨酸、蛋氨酸、脯氨酸含量減少，與正常對照組相比均具有顯著性(p＜0.05），這可能是由于癌癥細胞的蛋白質(zhì)代謝紊亂造成的，該結(jié)果與肺癌患者血、尿代謝組學研究結(jié)論基本吻合［13-16］。

圖 2 人肺癌細胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人胚肺成纖維細胞MRC-5的(a）極性、(b）非極性代謝物的PLS-DA分類圖Fig.2 PLS-DA results of(a）polar-metabolites and(b）non-polar metabolites of lung tumor cell lines H358，A549，HCC827，H1299，Calu-3，Calu-1，PC-9 and normal cell line MRC-5

L-肉堿主要參與脂肪酸代謝，其主要功能是將脂肪酸從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體進行β-氧化，并以?；鈮A的形式儲備能量。與對照組細胞相比，腫瘤細胞的丁酰-L-肉堿與2-甲基丁?；鈮A含量顯著增加，這可能是由于腫瘤細胞快速復(fù)制導(dǎo)致脂肪酸的β-氧化下調(diào)造成的。

鞘氨醇是細胞生命活動中的重要信號分子，通過神經(jīng)酰胺酶途徑與鞘氨醇激酶途徑直接參與細胞的增殖與凋亡調(diào)控。正常細胞內(nèi)的神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇水平通過動態(tài)平衡維持細胞的正常生理功能。與對照組細胞相比，腫瘤細胞的鞘氨醇含量顯著增加，提示在腫瘤細胞中神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇的動態(tài)平衡被打破，這可能是由于鞘氨醇激酶途徑被異常激活。鞘氨醇激酶途徑的異常激活與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切關(guān)系［17］。

在腫瘤細胞的非極性代謝物層，多種卵磷脂和縮醛磷脂含量有不同程度的上調(diào)，Cer d42:2以及多種鞘磷脂水平明顯下調(diào)，提示腫瘤細胞磷脂代謝通路發(fā)生紊亂。卵磷脂水平增高可能是由于腫瘤細胞能通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成高含量不飽和脂肪酸的卵磷脂。縮醛磷脂是存在于哺乳動物組織內(nèi)含烯醚鍵的甘油磷脂，據(jù)文獻［18］報道，在腫瘤組織中縮醛磷脂水平增高，其原因可能與多種參與合成或降解縮醛磷脂的酶活性改變相關(guān)，包括磷酸二羥丙酮脂酰轉(zhuǎn)酶、磷脂酰胞苷轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D。鞘磷脂主要存在于細胞膜、脂蛋白和其他富含脂類的組織結(jié)構(gòu)上，鞘磷脂在鞘磷脂酶的作用下水解生成神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺是細胞凋亡過程中常見的第二信使分子，據(jù)文獻報道，神經(jīng)酰胺能誘導(dǎo)多種腫瘤細胞的凋亡，如U937和JB6腫瘤細胞等［19，20］。

表1 肺癌細胞與正常細胞的極性代謝差異物鑒定結(jié)果Table 1 Summary of the differential polar metabolites between lung tumor cell lines and normal cell line

表2 肺癌細胞與正常細胞的非極性代謝差異物鑒定結(jié)果Table 2 Summary of the differential non-polar metabolites between lung tumor cell lines and normal cell line

實驗中還發(fā)現(xiàn)，與對照組細胞相比，腫瘤細胞LPC 18:1含量下調(diào)，這與許多癌癥代謝組學的文獻［21-23］報道一致。LPC在血液中主要受溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移酶與磷脂酶調(diào)控，有研究表明，在直腸癌患者體內(nèi)溶血磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)移酶被過度表達;另外，癌癥患者磷脂酶活性增高均可能導(dǎo)致LPC降低。

3 結(jié)論

本文提出了一種同時提取細胞極性與非極性代謝產(chǎn)物的方法，并采用HPLC-MS技術(shù)對7種人肺癌細胞 H358、A549、HCC827、H1299、Calu-3、Calu-1、PC-9及人正常胚肺成纖維細胞MRC-5進行分析，獲得了8種細胞的代謝物圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計分析手段研究了腫瘤細胞與正常細胞的圖譜變化情況，結(jié)果表明，腫瘤細胞與正常細胞的代謝物譜圖有顯著變化。通過對一些具有顯著性差異的物質(zhì)進行初步鑒定，得到了10種極性代謝差異物與21種非極性代謝差異物。與正常細胞相比，腫瘤細胞在蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝方面發(fā)生不同程度的紊亂，與現(xiàn)有文獻報道情況基本相符，證明通過細胞代謝物的差異表達來尋找潛在疾病標志物是一種極有前景的手段，與傳統(tǒng)的以病人血液、尿液為樣本的代謝組學研究相互佐證與補充。進一步還可以動物模型和組織為樣本，采用本文的方法對極性代謝差異物和非極性代謝差異物進行分析和驗證，以期為研究癌癥疾病機制、篩查或治療提供一種新的有效平臺。

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