朱 琳， 阮麗萍， 劉華良， 吉文亮， 馬永建，*

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009;2.江蘇省疾病預(yù)防與控制中心，江蘇南京 210009）

慢性失眠一直是困擾各國民眾的常見病、多發(fā)?。?］。精神藥品包括苯二氮類、巴比妥類、非苯二氮類抗焦慮劑［2］，常用于治療失眠、焦慮等臨床疾病;但這類藥物副作用大，且治標(biāo)不治本，需長期服用，易產(chǎn)生依賴性。某些生產(chǎn)廠家利用保健品成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等監(jiān)管空缺，在保健品中非法添加精神藥品以提高其產(chǎn)品的療效，欺騙消費(fèi)者。建立保健品中非法添加精神藥品的快速檢測方法對防止和打擊此類不法行為，保障人民健康具有極為重要的意義。

精神藥品的濫用一直是全球關(guān)注的重點(diǎn)之一。各類基質(zhì)中多種微量精神藥品的檢測均有報(bào)道，包括血液［3］、尿液［4］、頭發(fā)和指甲［5］、唾液［6］、奶制品［7］、動(dòng)物組織［8］、中成藥及保健品［9，10］等。檢測方法有薄層色譜法［11］、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA）［12］、HPLC 法［13，14］、GC 法［15，16］、GC-MS法［17］、HPLC-MS/MS 法［18，19］和 UPLC-Q-TOF-MS法［20］等。保健食品中通常含有多種中藥材，基質(zhì)復(fù)雜多樣，薄層掃描法、ELISA和HPLC法在定性時(shí)容易出現(xiàn)假陽性，已經(jīng)不適用于保健食品中精神藥品分析的要求。GC和GC-MS對部分藥物的分析需要進(jìn)行衍生化，費(fèi)時(shí)較長。HPLC-MS/MS法靈敏度高，選擇性和特異性好，在多組分微量成分的分析上顯示出了極大的優(yōu)越性，被越來越多地用于保健食品中非法添加化學(xué)藥物的研究。目前已報(bào)道的檢測方法多為同時(shí)檢測幾種［7-10］或十余種［3-6］精神藥品，而且多為早期臨床上使用的鎮(zhèn)靜安神類藥物。隨著醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展，更多的化學(xué)藥物用于失眠癥的治療［21，22］。生產(chǎn)企業(yè)也會選擇尚未被監(jiān)測的活性成分添加。建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高、定性和定量準(zhǔn)確、能同時(shí)檢測數(shù)十種精神藥品的分析方法勢在必行。本研究收集了臨床上具有鎮(zhèn)定安神效果的23種化學(xué)藥物，建立了可以對其同時(shí)檢測和確證的HPLC-MS/MS法，為保健食品中違禁精神藥品的監(jiān)督提供了有力的工具。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACCELA高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源，美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)）;D-78224超聲波清洗機(jī)(德國Elma公司生產(chǎn)）;Sigma 1-14離心機(jī)(德國賽多利斯公司）;甲醇、乙腈和甲酸銨均為色譜純(迪馬公司）;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司）制備。標(biāo)示具有改善睡眠功能的保健食品樣品購自本地超市及本實(shí)驗(yàn)室檢品。

23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)品:阿普唑侖(alprazolam）、異戊巴比妥(amobarbital）、氯硝安定(clonazepam）、氯氮卓(chlordiazepoxide）、安定(diazepam）、艾司唑侖(estazolam）、勞拉西泮(lozazepam）、安寧(meprobamate）、安眠酮(methaqualone）、咪唑安定(midazolam）、硝基安定(nitrazepam）、去甲安定(nordiazepam）、奧沙西泮(oxazepan）、苯巴比妥(phenobarbital）、三唑侖(trizolam）、扎來普隆(zaleplon）(1 mg/mL甲醇溶液，美國Cerilliant公司）;阿扎哌隆(azaperone）和氯丙嗪(chlorpromazine）(德國 Dr.Ehrenstorfer實(shí)驗(yàn)室）;巴比妥(barbital）和氯氮平(clozapine）(中國食品藥品檢定研究院）;氟哌啶醇(haloperidol）、奮乃靜(perphenazine）和賽拉嗪(xylazine）(Sigma公司）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取一定量的固體標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇為溶劑，分別制備質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。購于Cerilliant公司的上述對照品甲醇溶液亦作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。于-20℃冰箱中保存。

分別精密量取上述23種對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥均為100 mg/L，含安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜均為2 mg/L，含其他14種對照品均為10 mg/L的混合對照品儲備液。

1.2 樣品處理

取供試品(片劑，取數(shù)片，研細(xì);膠囊劑，取數(shù)粒，傾取內(nèi)容物，研細(xì)），準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提取20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。于12000 r/min離心5 min，上清液用于HPLC-MS/MS測定。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜條件:色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(100 mm × 2.1 mm，3.5 μm）。流動(dòng)相 A 為 10 mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈-甲醇(1∶1，v/v）溶液。梯度洗脫程序:0～2 min，12%B;2～6 min，12%B～50%B;6～12 min，50%B;12～17 min，50%B～100%B;17～18 min，100%B～12%B;18 ～23 min，12%B。流速0.3 mL/min，柱溫 30℃，進(jìn)樣體積 10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離正離子模式(ESI+）和負(fù)離子模式(ESI-）切換;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM）;噴霧電壓:+3.0 kV 或 -2.5 kV;輔助氣(N2）流量:3.0 L/min;鞘氣(N2）流量:12 L/min;碰撞氣(Ar）壓力:0.200 Pa(1.5 mTor）;毛細(xì)管溫度:350 ℃;氣化溫度:400℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 23種精神藥品在MRM模式下檢測的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the 23 sedative drugs in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1 HPLC-MS/MS 條件優(yōu)化

首先利用流動(dòng)注射的方式對各種待測化合物的管透鏡電壓和碰撞能量進(jìn)行了優(yōu)化，得到的各物質(zhì)的特征離子和碰撞能量如表1所示。23種化合物的母離子均為準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+或［MH］-;2種電離方式可以同時(shí)檢測。

為了獲得良好的分離效果和離子化效率，本實(shí)驗(yàn)對流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。分別比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，水、乙酸銨和甲酸銨作為水相的分離效果。結(jié)果將甲醇和乙腈按1∶1的體積比混合作為有機(jī)相的分離效果最好;水相中加入緩沖鹽，多個(gè)化合物的拖尾峰形得到明顯的改善，響應(yīng)值增大;甲酸銨與乙酸銨相比，能使保留時(shí)間短的化合物出峰時(shí)間延長，減少了基質(zhì)的干擾。最終將流動(dòng)相確定為甲醇-乙腈(1∶1，v/v）為有機(jī)相，10 mmol/L 甲酸銨溶液作水相，梯度洗脫分離。

優(yōu)化條件下23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖見圖1。

圖1 23種精神藥品標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖Fig.1 Chromatograms of a mixed standard solution of the 23 sedative drugs in MRM mode

2.1.2 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)中23種目標(biāo)化合物于甲醇中均有較好的溶解度，故選擇不同濃度的甲醇水溶液作提取溶劑，比較其提取效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇濃度越低，提取液的顏色越深，水溶性雜質(zhì)越多。對于大多數(shù)保健品，以100%甲醇提取時(shí)，高速離心后的提取液比較潔凈，無需進(jìn)一步凈化，簡化了樣品前處理過程，最終確定以甲醇為提取液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)

為了比較樣品基質(zhì)對目標(biāo)化合物質(zhì)譜響應(yīng)的影響，以陰性口服液和陰性膠囊樣品制作空白基質(zhì)溶液，分別添加相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品制備空白基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別以各分析物的峰面積(Y）和對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。巴比妥、異戊巴比妥、苯巴比妥的線性范圍為 0.1 ～10 μg/L，安眠酮、咪唑安定、氯硝安定、阿扎哌隆、氟哌啶醇、奮乃靜的線性范圍為0.002 ～0.2 μg/L，其他 14 種化合物的線性范圍為0.01～1 μg/L。在線性范圍內(nèi)，各分析物均有良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R2均不小于0.990）。口服液和膠囊樣品基質(zhì)使得某些目標(biāo)化合物質(zhì)譜信號增加或減少，如賽拉嗪、安眠酮、硝基安定、扎來普隆、氯硝安定、氯氮平、阿扎哌隆等，但其斜率變化均在標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的±20%范圍內(nèi)，因而可忽略基質(zhì)效應(yīng)［23，24］。

2.2.2 檢出限與定量限

取混合對照品儲備液用甲醇倍比稀釋后測定，以信噪比約為3時(shí)對應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為檢出限;以信噪比約為10時(shí)對應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限。各目標(biāo)藥物的檢出限和定量限結(jié)果見表2。

2.2.3 加標(biāo)回收率和精密度

以不含目標(biāo)化合物的口服液和膠囊保健品為本底，分別在3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率測定。巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥的3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.1、1和10 mg/L;安眠酮、氟哌啶醇、阿扎哌隆、咪唑安定、氯氮平和奮乃靜6種化合物分別為0.002、0.02 和 0.2 mg/L;其他 14 種化合物分別為0.01、0.1 和1 mg/L;平行測定 6 次，以評價(jià)該方法的準(zhǔn)確度。所得到的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD）見表2。所得結(jié)果均符合食品理化檢測要求［25］。

表2 23種精神藥品的檢出限、定量限及其在空白口服液和膠囊保健品中的加標(biāo)回收率和精密度Table 2 Limits of detection(LODs），limits of quantification(LOQs）and recoveries and relative standard deviations(RSD）spiked in blank oral liquid and capsule samples at three spiked levels of the 23 sedative drugs

2.3 樣品測定

分別按1.2節(jié)的方法處理13種樣品，依法測定。結(jié)果表明，13種保健品中有一種添加了安寧(207 μg/kg），一種添加了奧沙西泮(5.1 mg/kg），2種添加了扎來普隆(分別為53和511 μg/kg）。

3 結(jié)論

本文建立了HPLC-MS/MS檢測保健品食品中非法添加23種鎮(zhèn)靜安神類化學(xué)藥品的方法。從實(shí)際樣品的檢測結(jié)果來看，本方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，適用于保健品中非法添加多種精神藥品的確證定量檢測，為控制保健品質(zhì)量、打擊保健品行業(yè)非法添加行為提供有效依據(jù)。

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