魏黎明， 陸豪杰， 楊芃原， 武 欣

(1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院＆化學(xué)系，上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點實驗室，上海 200011）

肽組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性低分子量蛋白質(zhì)或多肽(low-molecular weight protein or polypeptides，LMWP）及其變化規(guī)律的科學(xué)［1］。目前國際上的權(quán)威組織(如國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC））對肽組學(xué)中LMWP的分子量范圍無明確界定，大多數(shù)科學(xué)家將低于20 kDa的蛋白質(zhì)或肽確定為肽組學(xué)的研究目標(biāo)，個別科學(xué)家也將其上限擴(kuò)大到50 kDa［2］。被關(guān)注的LMWP分為兩類，一類是體內(nèi)自身存在的活性多肽，如激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)肽等;另一類是由體內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)特殊水解酶進(jìn)行特異性水解的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以自由通過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán);LMWP作為參與生命活動中細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤發(fā)生和發(fā)展、免疫細(xì)胞滲透等進(jìn)程的產(chǎn)物，反映了機(jī)體發(fā)生病變的代謝水平［3-5］。在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對血液等樣本中LMWP的研究可以為臨床疾病的早期診斷提供高靈敏、高特異性的分子標(biāo)志物［6］。同時，針對內(nèi)源性LMWP的活性酶相關(guān)性、后修飾以及與其相互作用蛋白質(zhì)的更深入研究也將有助于探索疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制等。近幾年，肽組學(xué)的研究獲得了迅速的發(fā)展，在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、疾病早期診斷、生物制藥等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

肽組學(xué)研究過程包括樣品前處理、分離分析、檢測、定性、定量和數(shù)據(jù)分析，其中樣品前處理是整個過程的基礎(chǔ)［7，8］。生物標(biāo)本離開活體后易受外界條件影響，LMWP的真實表達(dá)水平將發(fā)生不同程度的變化，從而阻礙了肽組學(xué)數(shù)據(jù)向臨床領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。因此如何在處理樣品過程中維持LMWP的穩(wěn)定就變得越來越重要［9］。此外，在細(xì)胞、組織、體液中發(fā)揮重要生理功能、具有研究意義和價值的LMWP豐度較低，因此如何在高度復(fù)雜、動態(tài)范圍廣的生物體系中獲得低豐度的內(nèi)源性LMWP也是關(guān)鍵的一步。面對上述問題，肽組學(xué)樣品前處理方法和技術(shù)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，這也為研究者發(fā)展樣品前處理新方法和新技術(shù)提供了良好的契機(jī)。本文將從標(biāo)本準(zhǔn)備、變性前處理、LMWP提取富集方法三方面進(jìn)行綜述。

1 標(biāo)本準(zhǔn)備

標(biāo)本從生物機(jī)體分離后，機(jī)體調(diào)控平衡被打破，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的種類、含量和修飾快速變化，樣本中提取、富集、檢測到的部分蛋白質(zhì)實際上是高豐度蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的片段，而不是此類蛋白質(zhì)在標(biāo)本中的真實表達(dá)水平［10］。人類蛋白質(zhì)組學(xué)專業(yè)委員會(Human Proteome Organisation，HUPO）在完成人類血漿蛋白質(zhì)組計劃過程中，為排除上述問題專門成立了標(biāo)本采集和處理委員會(the Specimen Collection and Handing Committee，SCHC）并制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。LMWP受水解酶的影響，更易在樣本收集、存儲、處理過程中發(fā)生表達(dá)水平的變化。為獲得準(zhǔn)確、可信的肽組學(xué)信息，科研工作者對肽組學(xué)的標(biāo)本準(zhǔn)備提供了縝密的實驗數(shù)據(jù)和建議，為肽組學(xué)在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。Di Girolamo等［11］采用C18磁性微球-基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS）聯(lián)用技術(shù)，評價了不同標(biāo)本準(zhǔn)備條件(凝血時間、存儲溫度和時間、添加蛋白酶抑制劑與否）下血清中LMWP的變化情況，給出標(biāo)本應(yīng)盡量在2 h凝血時間、4℃下存儲1 h內(nèi)或-80℃下存儲1個月內(nèi)、無蛋白酶抑制劑加入的情況下完成血清多肽組學(xué)分析的建議。Banks等［12］提出在血清多肽組學(xué)分析過程中應(yīng)建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)譜峰;血清需要在活化劑處理的采血管中凝血1 h后進(jìn)行收集、儲存或分析;加入抗凝劑的血漿標(biāo)本應(yīng)盡量在1 h內(nèi)完成測試分析，從而保證樣本中LMWP的穩(wěn)定性。Zimmerman等［13］則通過 LC-MS/MS以及多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)對血清和血漿標(biāo)本準(zhǔn)備過程中多肽以及蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明血漿在4℃保存1周以及反復(fù)凍融25次等條件下，血漿中LMWP的穩(wěn)定性大大高于現(xiàn)有的其他文獻(xiàn)推斷，從而進(jìn)一步證實血清和血漿多肽組學(xué)向臨床醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用切實可行。在唾液的多肽組學(xué)分析過程中，de Jong等［14］發(fā)現(xiàn)快速凍存唾液標(biāo)本可以獲得高回收率的肽組學(xué)譜，病人的營養(yǎng)狀態(tài)、標(biāo)本室溫存儲15 min內(nèi)對唾液中的LMWP無明顯影響;采用雙向熒光差異凝膠電泳以及LC-MS/MS技術(shù)，Scholz等［15］首次評價了快速液氮凍存、快速加熱失活以及快速液氮凍存后熱失活處理肝臟和腎臟組織標(biāo)本的蛋白質(zhì)以及對LMWP的降解變化情況，證實在快速液氮凍存標(biāo)本中出現(xiàn)了大量降解產(chǎn)物。快速液氮凍存方法會破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使標(biāo)本融化后降解和修飾蛋白質(zhì)的酶分布得更廣泛，導(dǎo)致更多蛋白質(zhì)或其修飾形式發(fā)生改變，因此快速熱失活處理方法相對快速液氮凍存方法更嚴(yán)謹(jǐn)。對于尿、淚液等標(biāo)本，科研工作者建議低溫儲存，加入少量蛋白酶抑制劑防止非內(nèi)源性水解肽的產(chǎn)生，保持標(biāo)本準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化，從而真實可信地反映生物體的多肽水平，為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)保障。

2 標(biāo)本變性前處理

眾所周知，血清中高豐度蛋白質(zhì)(白蛋白或免疫球蛋白等）對LMWP具有綁定和運輸?shù)淖饔茫襆MWP的豐度低，因此科研工作者采用不同的變性條件對血清進(jìn)行變性前處理，該過程不僅有效削弱LMWP與高分子量蛋白質(zhì)(highmolecular weight protein，HMWP）之間的作用力，而且使水解酶的活性降低，從而提高了血清樣本中LMWP的回收率，更真實地反映標(biāo)本中LMWP的表達(dá)水平。Zhou等［16］采用免疫共沉淀技術(shù)富集血清中6種高豐度蛋白質(zhì)后，以0.2%(v/v）甲酸或6 mol/L尿素解離與其相互作用的LMWP，并超濾收集、酶解、質(zhì)譜鑒定，獲得了210種蛋白質(zhì)信息，從而證實變性處理樣本對提高LMWP回收率和數(shù)目是必要的。Tirumalai等［17］采用5倍體積的25 mmol/L碳酸氫銨/20%乙腈(pH 8.2）進(jìn)行血清變性，相比5倍體積的25 mmol/L碳酸氫銨稀釋液處理血清中LMWP的回收率提高約30%～40%。Kawashima等［18］則采用2倍體積的蛋白質(zhì)提取液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、20 mmol/L二硫蘇糖醇）進(jìn)行血清變性，結(jié)合不同溶解度方法進(jìn)行 LMWP的提取。Vitorino等［19］則強(qiáng)烈建議收集唾液標(biāo)本后迅速加入尿素并超聲變性，該處理方法對唾液中LMWP回收率的提高及其穩(wěn)定性更為有利。Good等［20］采用等體積的2 mol/L尿素、10 mmol/L 氨水、0.02%(w/w）十二烷基磺酸鈉稀釋液對尿液樣本進(jìn)行變性處理并釋放與 HMWP作用的 LMWP。Ziganshin等［21］對血清進(jìn)行98℃加熱15 min的變性處理，為獲得高回收率、穩(wěn)定性的血清LMWP數(shù)據(jù)提供了簡單可行的方法。因此，除樣本LMWP需要進(jìn)行免疫實驗外，為保證LMWP高的回收率和富集重現(xiàn)性，變性前處理步驟是必要的。然而，部分研究者認(rèn)為對標(biāo)本的附加處理將引起LMWP的變化，因此他們直接進(jìn)行血清中 LMWP的提取分析。如 Fan等［22］利用不同吸附機(jī)理的磁珠對大腸癌血清中的LMWP直接進(jìn)行提取富集。針對不同提取富集方法，變性前處理所用的試劑和方式也不盡相同。

目前對細(xì)胞以及組織標(biāo)本的變性前處理方法有加熱、微波照射處理、輔助添加劑提取等。傳統(tǒng)細(xì)胞或組織標(biāo)本中LMWP的變性提取方法是在熱水中變性后以不同溶解度的提取液進(jìn)行處理［23］。Bora等［24］采用90℃熱水中變性10 min，再以預(yù)冷酸性丙酮(丙酮/水/鹽酸(40∶6∶1，v/v/v））以及酸溶液(0.25%(v/v）乙酸）順序提取大鼠下丘腦視上核的LMWP，檢測到85條肽，其中發(fā)現(xiàn)了20條新的激素源肽。Sturm等［25］采用生物樣品穩(wěn)定儀(Stabilizor T1）變性處理甲殼動物的心包器官組織，并以酸性甲醇、N，N-二甲基甲酰胺為提取液進(jìn)行LMWP的提取，證實傳統(tǒng)方法在甲殼動物肽組學(xué)研究中切實可行，并給出了熱變性在LMWP提取中的必要性。Svensson等［26］采用聚焦微波輻射(4.5 ～5 kW，1.4 s）處死小鼠，并使腦組織內(nèi)水解酶失活，取樣后快速液氮研磨，以0.25%(v/v）乙酸溶液超聲波提取腦組織中的LMWP，在1 mg下丘腦組織中獲得了550個內(nèi)源性神經(jīng)肽峰，相對于無微波輔助處理的鼠腦樣本可以有效降低血紅蛋白的降解肽峰［27］，因此聚焦輻射后液氮研磨提取方法可以有效降低水解酶的活性并維持內(nèi)源性LMWP的后修飾狀態(tài);但該方法儀器成本高，處理后的LMWP不能進(jìn)行免疫檢測反應(yīng)分析。Che等［28］將取樣后的鼠腦迅速置于微波爐(1.38 kW）中加熱處理8 s后迅速液氮凍存;研磨后的腦組織在70℃熱水中超聲變性處理20 min，繼續(xù)加入預(yù)冷鹽酸溶液(10 mmol/L）提取內(nèi)源性神經(jīng)肽，獲得了95條神經(jīng)肽;通過同位素標(biāo)記評價該方法對鼠腦中LMWP的提取重現(xiàn)性，內(nèi)源性神經(jīng)肽變化在25%以內(nèi)。Romanova等［29］以二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid，DHB）為變性提取液，建立了一步處理、提取、儲存的肽組學(xué)新方法，即以水飽和DHB溶液對組織切片或細(xì)胞進(jìn)行LMWP的提取;采用MALDI-MS(600～4000 Da）分析，在小鼠腦垂體中檢測到24條已知內(nèi)源性神經(jīng)肽;該方法可以有效抑制超聲或加熱酸處理過程中蛋白質(zhì)天冬氨酸-脯氨酸鍵的斷裂(Asp-Pro在酸性條件下易水解斷裂）;同時，提取的LMWP在4℃下保存3年后仍然可以獲得非常好的質(zhì)譜檢測重現(xiàn)性。但該方法因DHB基質(zhì)結(jié)晶不均勻，在基于MALDI-MS定量分析LMWP中存在一定的局限性。

3 LMWP提取富集前處理方法和技術(shù)

內(nèi)源性LMWP的最大特點是分子量相對較小、豐度低。根據(jù)這一特點，研究者發(fā)展了不同的前處理方法和技術(shù)對血清、腦脊液、尿液、唾液、組織等生物樣本中的內(nèi)源性LMWP進(jìn)行提取富集，如超濾技術(shù)(分子量截留膜）、有機(jī)溶劑沉淀方法、固相萃取技術(shù)及其他技術(shù)等。

3.1 超濾技術(shù)

超濾技術(shù)是以膜表面的微孔結(jié)構(gòu)為介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力對樣品進(jìn)行選擇性分離的膜分離技術(shù)。超濾膜只允許溶液中小于特定分子量的分子通過，而大于特定分子量的分子被截留在膜上方，從而達(dá)到選擇性分離的目的。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域。在3000×g離心條件下，Tirumalai等［17］采用 Centriplus?截流膜(molecular weight cut-off，MWCO，30 kDa）有效排除了HMWP(如白蛋白）的干擾，提取富集了血清中的LMWP，并結(jié)合胰蛋白酶水解和LCMS/MS技術(shù)鑒定到340種蛋白質(zhì)。Harper等［30］以50 kDa MWCO截留膜處理100 μL血清，并結(jié)合溶液內(nèi)等電聚焦和LC-MS/MS技術(shù)給出了262種LMWP，LMWP的回收率大約在40%～60%。Zheng等［31］采用線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(LTQ-FT MS）分析了10 kDa MWCO處理后的血清樣本，在2 ppm精度下獲得了300條特異性肽。針對≤25 kDa的血清多肽，Greening等［32］對4種不同的MWCO膜進(jìn)行了比較分析，最終建立了在20℃、4000×g下，以Sartorius Vivaspin?截留膜處理100 μL 10%乙腈稀釋血清35 min的策略，獲得血清中LMWP的回收率約94%。Zougman等［33］將超濾技術(shù)用于腦脊液神經(jīng)肽富集時，充分顯示了該技術(shù)的優(yōu)勢，在2 mL腦脊液中鑒定得到了563條肽(歸屬于91種蛋白前體），其多為N-端焦谷氨酸化、C-末端酰胺化并且含有高半胱氨酸，這些數(shù)據(jù)為腦脊液肽組學(xué)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。此外，不同尺度的MWCO膜(5～50 kDa）也被成功用于唾液、尿液、腦脊液、淚液、組織提取液中LMWP的提取富集［34，35］。超濾技術(shù)在LMWP樣品前處理中得到了廣泛的應(yīng)用，但該技術(shù)仍存在以下缺點有待于解決，如:膜上層濃縮后的大分子堵塞膜孔，導(dǎo)致超濾速度過慢或停滯;超濾膜對LMWP有一定的吸附作用;其他鹽類等干擾小分子與LMWP共富集;對大體積樣本處理耗時;不同廠家生產(chǎn)的超濾裝置重現(xiàn)性和回收率不穩(wěn)定等現(xiàn)象。

3.2 有機(jī)溶劑沉淀法

有機(jī)溶劑沉淀法的原理是有機(jī)溶劑的加入可以降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致溶液中大分子量蛋白質(zhì)之間疏水作用力下降、靜電作用力增強(qiáng)，從而相互聚集，直至析出，而溶液中的LMWP則溶解在有機(jī)溶劑中。實驗中使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、乙腈、丙酮，以及非有機(jī)溶劑三氯乙酸、飽和性無機(jī)鹽等。早在1946年乙醇就被用于血漿中白蛋白的富集沉淀。Alpert等［36］則最早提出用2倍體積的乙腈對血清中高分子量、高豐度蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀處理，從而獲得小于20 kDa的LMWP;Kay等［37］采用MRM以及凝膠電泳技術(shù)對該方法進(jìn)行了評價，在大于75 kDa范圍內(nèi)無相關(guān)蛋白質(zhì)的檢出，并證明該方法有效去除了99.6%的 HMWP。Tucholska 等［38］比較不同有機(jī)溶劑時發(fā)現(xiàn)，冰丙酮對HMWP的沉淀最完全;甲醇作為沉淀試劑使用時，在LMWP收集液中可以檢測到大量的白蛋白，因此不推薦使用。Polson等［39］比較了有機(jī)溶劑、酸、鹽和金屬離子添加劑對HMWP的剔除情況，最終發(fā)現(xiàn)乙腈可以獲得大于96%的沉淀效率。Chertov等［40］則發(fā)展了一種添加離子對試劑三氟乙酸的有機(jī)溶劑沉淀新方法，該試劑有利于LMWP從高豐度蛋白質(zhì)上的解離，同時體系pH值低于蛋白質(zhì)等電點時更有利于蛋白質(zhì)與離子試劑的共沉淀。針對樣本收集量較低的淚液，Hayakawa等［41］用 3 倍體積的 90%(v/v）甲醇/0.1%(v/v）甲酸溶液進(jìn)行LMWP的提取富集，在淚液中發(fā)現(xiàn)了約30條多肽，為其后續(xù)生理作用研究提供了基礎(chǔ)。趙龍山等［42］也曾采用3%(v/v）甲酸/乙腈溶液進(jìn)行大分子量蛋白質(zhì)的沉淀。Kawashima等［43］根據(jù)不同有機(jī)溶液的使用，發(fā)展了一種不同溶解度沉淀HMWP的新方法(differential solubilization，DS）并且與Chertov等的有機(jī)溶劑/離子對試劑沉淀方法、30 kDa MWCO以及高豐度蛋白剔除試劑盒(ProteoExtract白蛋白/IgG）進(jìn)行了比較，該方法對LMWP獲得了更好的回收率和重現(xiàn)性。針對唾液樣本分析，Vitorino等［44］將有機(jī)溶劑沉淀法與超濾技術(shù)進(jìn)行了比較，經(jīng)碳酸氫銨/乙腈變性處理樣本后超濾的方法對≤10 kDa LMWP的富集能力和鑒定肽數(shù)目上更勝一籌。Potier等［45］向血漿樣本中加入合成的定量串聯(lián)體(QconCAT）蛋白質(zhì)酶解肽段，并結(jié)合相對和絕對定量的質(zhì)量差異標(biāo)簽(mTRAQ）和MRM技術(shù)，對C8磁珠固相萃取、5 kDa MWCO超濾法、乙腈有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)行了比較，證實在LMWP的回收率和重現(xiàn)性上，2倍體積的乙腈有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)于其余兩種方法。鑒于不同的研究者獲得了不同的優(yōu)化結(jié)果，因此在LMWP的樣品前處理過程中需要建立標(biāo)準(zhǔn)程序，以便實現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。有機(jī)溶劑沉淀法用于LWMP提取富集的不足之處在于:對于LMWP的富集無明確的分子量范圍;鹽類等干擾小分子與LMWP共富集;部分LMWP存在可能共沉淀的現(xiàn)象以及大量有機(jī)溶劑的使用稀釋了LMWP。但該方法相對于其他方法具有快速、簡單、成本低的優(yōu)勢。

3.3 固相萃取技術(shù)

固相萃取(solid phase extraction，SPE）是從上世紀(jì)80年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術(shù)，用于樣品的分離、凈化和富集。在肽組學(xué)應(yīng)用中，除使用常規(guī)的疏水、親水、離子相互作用的固相萃取柱外，新型萃取富集材料也得到了充分發(fā)展，如:表面增強(qiáng)激光解吸離子化(surface-enhanced laser desorption/ionization，SELDI）芯片、磁性富集材料、納米材料、限進(jìn)材料等。

3.3.1 SELDI芯片

SELDI芯片，即芯片表面經(jīng)化學(xué)(陽離子、陰離子、疏水、親水和金屬離子螯合等）或生物化學(xué)(抗體、受體、核酸等）處理，可以特異性地與樣本中的蛋白質(zhì)結(jié)合，并與激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，繪制蛋白質(zhì)指紋圖譜;表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF MS）將芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，集蛋白質(zhì)樣品前處理、生物分子反應(yīng)、檢測分析過程于一體，實現(xiàn)了高效、快速、高通量的檢測。國內(nèi)外學(xué)者曾經(jīng)針對該技術(shù)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的綜述［46，47］。SELDI 芯片可以用于血清、尿液、乳房分泌液、細(xì)胞破碎液等樣本中LMWP疾病標(biāo)志物的篩查分析，但由于SELDI儀器精度、串級分析限制以及實驗操作重現(xiàn)性等問題，芯片的使用受到了一定的限制。Zhang等［48］利用不同萃取機(jī)理芯片(IMAC3-Cu、SAX2、H50以及 WCX2）萃取富集血清中的LMWP，并結(jié)合SELDI-TOF MS在早期卵巢癌血清中篩查到載脂蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素以及蛋白酶抑制劑H4多肽(3272 Da）潛在分子標(biāo)志物。Peng等［49］將IMAC-Cu SELDI芯片與四極桿飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用，在m/z＜6 kDa范圍內(nèi)鑒定了血清中21條 LMWP的序列。Winder等［50］將 IMAC-Cu芯片應(yīng)用于48對乳腺癌血清標(biāo)本分析，發(fā)現(xiàn)了蛋白酶抑制劑H4多肽、精氨酸過敏毒素C-末端片段等潛在分子標(biāo)志物。由于SELDI芯片在LMWP富集處理過程中具有方便、快捷、高通量的特點，其與新一代儀器的聯(lián)用在疾病早期診斷中有著遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景。

3.3.2 磁性富集材料

磁性材料的表面可進(jìn)行多種衍生化處理，其結(jié)合外磁場作用易于分離的特點也被生物學(xué)家用于LMWP的提取和富集。Villanueva等［51］采用不同長度碳鏈修飾的磁珠材料發(fā)展了一種血清多肽富集新方法，發(fā)現(xiàn) C8磁性微球(magnetic beads，MB）比MB-C1、-C2、-C3、-C18對 LMWP 的選擇富集能力更強(qiáng)，在50 μL 血清發(fā)現(xiàn)了 400 種 LMWP(0.8 ～1.5 kDa）;與乙醇沉淀、30 kDa MWCO超濾方法、親和色譜柱(Cibachron Blue填充物）提取富集LMWP相比，MB-C8對 LMWP有更好的回收率。Tiss等［52］則評價了 MB-C8、-C18、-WCX、Zip-tip C18以及 DBC18對血清中LMWP的富集能力以及重現(xiàn)性，指出MB-C8具有高富集能力，但重現(xiàn)性較差(變異系數(shù)(CV）=62.1%）;理想的處理方式為 Zip-tip C18，其在保證464個檢出峰時重現(xiàn)性仍維持較好的水平(CV=23.2%）。Baumann 等［53，54］采 用MB-HIC、MB-C8、MB-IMAC Cu、MB-WCX 分別建立了提取富集血清和尿液中LMWP的標(biāo)準(zhǔn)流程，并在1～10 kDa質(zhì)譜掃描范圍內(nèi)分別獲得了350個和427個LMWP信號。Gatlin等［55］則采用2%(v/v）三氟乙酸變性處理-50 kDa MWCO超濾-MB-C3富集聯(lián)用技術(shù)富集血清中的LMWP，該方法比超濾、超濾-SPE方法有更好的回收率和重現(xiàn)性。此外，MB-C8(一步法合成）、MB-f-C60、MB-油酸、MB-碳多糖-C8等新型磁性材料的發(fā)展也為LMWP的提取富集提供了新的選擇空間［56-58］。但大多數(shù)研究者沒有考慮新型磁性微珠制備批次對樣本處理重現(xiàn)性的影響，從而使其在實際臨床樣本中的應(yīng)用存在一定的限制。

3.3.3 納米材料

納米材料具有高比表面積、表面多官能團(tuán)、納米孔徑等特性，對生物分子具有優(yōu)越的富集能力，因此納米材料也被用于多肽或蛋白質(zhì)的富集分離。

碳納米材料(如碳納米管、納米金剛石、富勒烯、石墨烯等）具有多電子軌道特性，與疏水性化合物形成π-π作用，也可通過表面官能團(tuán)與化合物形成靜電作用，從而對多肽和蛋白質(zhì)具有富集能力。武春霞等［59］曾針對碳納米管在分離科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。Li等［60］建立了碳納米管富集血漿中LMWP的新方法，比C18、C8硅球具有更強(qiáng)的富集能力，在50 μL血漿中鑒定到374條內(nèi)源性肽。Vallant等［61］則首次將C60及其衍生物用于血清肽組學(xué)研究，建立了完整分析2～30 kDa LMWP的新策略。納米金剛石也被用于分析尿液和血清中的LMWP［62］。聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA）與多肽或蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的疏水作用力，Yin等［63］采用PMMA衍生化石墨烯(石墨烯@SiO2@PMMA）用于鼠腦中疏水性神經(jīng)肽的選擇性富集。

無機(jī)納米材料則通過靜電作用、疏水作用以及體積排阻等特性使HMWP排除在材料孔徑外側(cè)，小于孔徑的LMWP則可以被提取富集。納米沸石最早用于溶液中多肽的富集分離，隨后不同孔徑的納米硅材料以及芯片也被用于LMWP的提取。Tian等［64］比較了不同孔徑(2 nm、8 nm、12 nm）的 MCM-41納米硅球?qū)ρ錖MWP的提取富集能力，發(fā)現(xiàn)2 nm MCM-41可以有效截留12 kDa的HMWP，對1～12 kDa的LMWP具有明顯的富集提取能力。調(diào)節(jié)血清pH為2.5并結(jié)合2D-LC-MS/MS分析，在4 mL血清樣本中得到了1680條特異性肽［65］。由于MCM-41材料對疏水性肽具有特殊的富集能力，為提高對血清中LMWP的富集能力，該課題組采用新型有序介孔碳材料(ordered mesoporous carbon material，OMC）對血清中LMWP進(jìn)行提取富集，4.8 nm的OMC可以截留大于10 kDa的HMWP，即使對＜2 kDa的多肽仍然具有很好的提取富集能力;與2DLC-MS/MS聯(lián)用，在20 μL血清中富集鑒定到3402條內(nèi)源性肽［66］。根據(jù)上述無機(jī)納米材料富集LMWP的特點，科研工作者也合成了其他新型納米孔徑材料并用于血清、誘導(dǎo)痰、組織提取液等樣本中LMWP的提取富集，如介孔硅球［67］、介孔有機(jī)硅微球［68］、介孔硅鋁［69］、C8-石墨烯-修飾介孔硅材料［70］等。通常采用離心方式對上述無機(jī)納米材料進(jìn)行收集，但該收集方式費時，并對樣本體積有所限制。為方便、快捷地處理大體積樣本，磁性材料與納米孔徑結(jié)構(gòu)材料復(fù)合體獲得了發(fā)展，如介孔硅磁性微球(MB@nSiO2@mSiO2、MB@mSiO2）以及 C8-、Cu2+、氨基等修飾的磁性多孔硅球MB@mSiO2-C8、MB@mSiO2-Cu2+等被用于LMWP的富集分離，從而大大縮減了樣品前處理時間［71-73］。Zhu 等［74］則將制備的有序介孔二氧化硅纖維填充在注射器進(jìn)樣針頭尾部，更加方便地實現(xiàn)了樣品的載樣、清洗、洗脫過程(3 min），大大提高了實驗效率以及實驗重現(xiàn)性。上述大多數(shù)材料需要將LMWP洗脫、濃縮后進(jìn)行質(zhì)譜分析，為提高LMWP分析的回收率、重現(xiàn)性以及實驗效率，F(xiàn)errari等［75］通過三嵌段共聚物模板途徑制備了3D介孔硅芯片，實現(xiàn)了原位富集、清洗、洗脫，成為傳統(tǒng)納米材料在LMWP提取富集中的一大創(chuàng)新。根據(jù)致孔劑的不同，該課題組獲得了3.7 nm、5.2 nm、7.4 nm、9.0 nm 孔徑的芯片，結(jié)果表明 3.7 nm和9.0 nm孔徑芯片可以分別對900～3500 Da和3600～8500 Da范圍內(nèi)的多肽進(jìn)行特異性的富集。同時該芯片對LMWP具有一定的存儲能力，富集LMWP的芯片室溫放置3周后LMWP各峰的峰強(qiáng)的變異系數(shù)僅為12.7%，因此該芯片有望在臨床診斷標(biāo)志物篩選中得到應(yīng)用。Tan等［76］則采用電刻蝕方法制備了不同孔徑的多孔硅微粒，富集LMWP的材料無需洗脫，可以直接在MALDI靶板上進(jìn)行質(zhì)譜分析。該方法在大腸癌血清肽組學(xué)研究應(yīng)用中，鑒定分析到82條內(nèi)源性多肽。上述納米材料在富集復(fù)雜體系中的LMWP時，為保證孔徑對HMWP的排阻能力，樣本盡量維持了其三維結(jié)構(gòu)而沒有進(jìn)行任何變性處理，因此不僅丟失了與HMWP有作用的LMWP，而且很難消除水解酶對樣本的降解作用，在實際應(yīng)用中存在一定的局限性。

對于其他無機(jī)納米材料(如納米金(銀）、金屬有機(jī)骨架材料等）也可以通過靜電和疏水作用力提取富集多肽。Sudhir等［77］建立了一種以納米金輔助單液滴微萃取多肽的新方法，即以分散納米金的甲苯為萃取相，通過調(diào)節(jié)溶液pH值(pH＜pI）使多肽得到微萃取富集。雖然該方法沒有直接用于樣本中LMWP的富集，但是其特點完全可以應(yīng)用于LMWP的提取富集。比表面積大、穩(wěn)定性好、納米孔徑的金屬有機(jī)骨架材料也被用于提取富集血清及尿液中的LMWP［78］。其他有機(jī)聚合膠束納米材料在對LMWP的富集提取中也有不俗的表現(xiàn)［79］。納米材料對LMWP的提取富集具有富集能力強(qiáng)、特異性顯著、不受樣本體積限制等特點，但是由于大多數(shù)納米材料在處理樣本中的LMWP時存在重現(xiàn)性評價問題，因此需要切實有效地建立和優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，為實際應(yīng)用鋪平道路。

3.3.4 限進(jìn)材料

限進(jìn)材料(restricted access material，RAM）是一種混合模式的固相萃取吸附劑，同時兼具對大分子的體積排阻功能和對小分子分析物的富集功能。該材料通過合適的孔徑使得生物大分子不能進(jìn)入材料內(nèi)孔;而孔內(nèi)修飾的疏水或離子交換基團(tuán)可實現(xiàn)對小分子分析物的萃取;并且親水性的外表面會保證對生物大分子不發(fā)生不可逆變性和吸附;因此RAM被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本、環(huán)境樣本的預(yù)處理［80］。樣本中LMWP與HMWP的顯著差別就在于分子尺度的大小，因此RAM更加適合在線提取富集LMWP。Wagner等［81］利用硅質(zhì) RAM 填充柱建立了比較繁瑣的二維離線富集分離系統(tǒng)，分析了成纖維細(xì)胞裂解液中＜20 kDa的LMWP，15個色譜峰的保留時間、峰面積以及峰高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在 0.04% ～ 2.41%、6.6% ～ 35.6% 以 及 4.4% ～25.6%之間(n=6）。Hu等［82］制備了體現(xiàn)強(qiáng)陽離子交換和體積排阻特征的RAM并與nano-C18反相色譜柱在線聯(lián)用，實現(xiàn)了血清中＜15 kDa LMWP的富集分析。采用一維色譜分析2 μL血清樣本時，獲得了400條內(nèi)源性多肽，3次技術(shù)重復(fù)達(dá)60%，峰的保留時間與峰強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在0.5%以及4%～25%之間，相比Wagner等建立的系統(tǒng)有更好的重現(xiàn)性。該系統(tǒng)同樣可以實現(xiàn)LMWP的多維分析，20 μL血清樣本中鑒定到的內(nèi)源性肽達(dá)到1286條，良好的重現(xiàn)性為準(zhǔn)確定量研究LMWP奠定了堅實的基礎(chǔ)。雖然在線RAM富集程序可以自動運行，但為獲得LMWP高的回收率，RAM填充柱在線富集的流速、pH、樣本稀釋倍數(shù)以及上樣量需要進(jìn)一步的優(yōu)化。

基于RAM材料的設(shè)計理念，一種體積排阻-親和水凝膠納米顆粒材料(size-exclusion-affinity hydrogel nanoparticles，SEAN）也得到了發(fā)展，材料內(nèi)部固定了目標(biāo)分子“誘餌”，而外殼水凝膠形成不同尺度的孔徑，對HMWP進(jìn)行體積排阻并特異性富集目標(biāo)分子，因此該材料兼顧了體積排阻色譜和親和色譜的特點。面對生物樣本復(fù)雜體系下LMWP富集分離的難題，該技術(shù)也發(fā)揮了它的優(yōu)勢。Luchini等［83］首次提出了以N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸復(fù)合納米顆粒作為富含負(fù)離子的SEAN對LMWP富集進(jìn)行了系統(tǒng)的考察和評價，分子截留能力＜14400 Da。而且其他科研工作者也發(fā)展了不同的“誘餌”，如:烷基胺、Cibacron Blue F3G-A、苯硼酸類、TiO2等，對樣本中的負(fù)電性LMWP、多肽、多聚糖、糖肽、核酸類以及磷酸化肽進(jìn)行了選擇性富集［84-86］。Luchini等［87］發(fā)展了含有17種“誘餌”的多聚水凝膠核殼納米顆粒，用于廣泛富集血清中＜30 kDa的LMWP，獲得了200種低豐度LMWP，該方法將鑒定低豐度蛋白質(zhì)的濃度豐度擴(kuò)大了5個數(shù)量級。SEAN有效結(jié)合了體積排阻和親和富集的特點，可以對LMWP進(jìn)行有效富集;但SEAN為多聚水凝膠材質(zhì)，其對溫度、外界壓力的耐受程度有限，通量性也受到了限制。結(jié)合RAM和SEAN的特點，Tian等［88］對4.8 nm MCM-41 納米孔徑硅材料進(jìn)行了強(qiáng)陽離子(SCX）和強(qiáng)陰離子(SAX）的修飾，將SAXMCM-41和SCX-MCM-41兩種材料與在線2D-LCMS/MS聯(lián)用在小鼠肝臟提取液中獲得了2721條內(nèi)源性多肽。該課題組又將Ti(Ⅳ）固定于MCM-41納米孔內(nèi)，以Ti為吸附“誘餌”、材料孔徑為體積排阻“篩孔”，對血清中內(nèi)源性磷酸化肽進(jìn)行了特異性富集，并結(jié)合iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)了人類肝癌血清樣本中潛在的磷酸化內(nèi)源性多肽標(biāo)志物［89］。Zhu等［90］將Ti(Ⅳ）-MCM-41用于500 μL人血清中內(nèi)源性磷酸化肽的富集，并結(jié)合反相液相色譜離線分離以及碰撞誘導(dǎo)碎裂和電子轉(zhuǎn)移裂解(CID和ETD）模式獲得了143條磷酸化內(nèi)源性肽(133個磷酸化位點，其中109個為首次報道），開啟了血清后修飾內(nèi)源性肽的特異性富集鑒定研究。Liu等［91］則采用氨基苯硼酸對MCM-41進(jìn)行修飾，在大鼠血清中獲得了15條糖基化內(nèi)源性多肽。上述新型RAM離線富集材料如可以實現(xiàn)在線富集能力，將為血清中LMWP以及后修飾的LMWP富集鑒定分析提供更優(yōu)異的平臺。

3.4 其他技術(shù)

除上述技術(shù)外，傳統(tǒng)的分離分析技術(shù)，如體積排阻色譜(size exclusion chromatography，SEC）、親和色譜(affinity chromatography，AC）、電泳技術(shù)以及電滲析技術(shù)等也被常用于提取富集LMWP。Hu等［92］利用SEC與LC-MS/MS聯(lián)用分析了小鼠肝臟提取液中的LMWP(Mr＜3000 Da），鑒定得到歸屬于371種蛋白質(zhì)的1181條內(nèi)源性多肽。但SEC的缺點是分辨率低，需要與其他多維分離技術(shù)聯(lián)用方可實現(xiàn)LMWP的鑒定檢出。針對血清等體液樣本，體系內(nèi)蛋白質(zhì)或多肽的含量跨越約12個數(shù)量級，親和色譜也被廣泛用于高豐度HMWP的剔除，使低豐度LMWP得到富集。Shen等［93］采用AC去除高豐度蛋白質(zhì)后，以SEC技術(shù)進(jìn)行＜20 kDa LMWP的提取富集并與LC-FT-MS/MS聯(lián)用，在人類血漿中獲得了歸屬于29種蛋白質(zhì)的200條內(nèi)源性肽。在采用十二烷基磺酸鈉強(qiáng)變性劑有效消除LMWP與HMWP的相互作用后，通過連續(xù)凝膠電泳分離，獲得了LMWP的提取富集，去除十二烷基磺酸鈉后進(jìn)行LMWP的鑒定分析。該體系樣本承載量范圍廣，但是后續(xù)需要去除強(qiáng)變性劑，增加了樣本處理步驟，可能引起LMWP的部分損失。新型選擇電泳MF10分離裝置是以聚丙烯酰胺膜(65 kDa、25 kDa、5 kDa、1 kDa）為分離膜，在電場作用下，蛋白質(zhì)或多肽根據(jù)不同尺寸和流動相pH進(jìn)行不同分子量范圍的收集，采用該技術(shù)檢測尿素變性處理后的血漿樣本，在1～5 kDa范圍鑒定到歸屬于22種蛋白質(zhì)的77條內(nèi)源性肽［94］。該技術(shù)所需最小樣本量在100 μL左右，使用范圍受到限制;同時由于多聚物膜的使用，存在非特異性吸附現(xiàn)象。

Kamphorst等［95］采用電滲析技術(shù)，鑒定了類風(fēng)濕性患者滑膜液中歸屬于12種蛋白質(zhì)的27條內(nèi)源性多肽，但該技術(shù)的重現(xiàn)性和回收率不理想。

Tanaka等［96］發(fā)展了一步電轉(zhuǎn)印結(jié)合 MALDIMS進(jìn)行肽組學(xué)分析的新方法，樣本直接采用凝膠電泳分離，凝膠通過電轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯樹脂膜(PVDF）上，再進(jìn)行MALDI-MS分析。采用該方法在妊娠高血壓孕婦血清樣本中發(fā)現(xiàn)了23條特異性內(nèi)源性多肽，為其早期預(yù)警提供了潛在的分子標(biāo)志物。雖然該技術(shù)實現(xiàn)了HMWP非剔除條件下肽組學(xué)的直接分析，但仍存在以下問題:4%～12%的凝膠電泳以及轉(zhuǎn)膜操作過程損失更多LMWP，從而影響LMWP的回收率和鑒定檢出效率;PVDF膜上LMWP的MALDI-MS分析影響LMWP的檢出靈敏度，因此該方法對LMWP的定量分析存在一定的局限性。

不同的樣品前處理方法具有不同的特征和優(yōu)勢，我們以血清肽組學(xué)研究為例，將上述樣品前處理技術(shù)鑒定的血清多肽情況進(jìn)行概括(見表1）?？傮w而言，固相萃取技術(shù)在選擇性和靈敏度上具有顯著的優(yōu)勢;有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)具有高通量、低成本、載樣體積大的特點;超濾以及其他技術(shù)在選擇性上也有獨特的特點;因此需要兼顧各方法的優(yōu)點進(jìn)行肽組學(xué)樣品前處理方法的選擇。

表1 各種肽組學(xué)樣品前處理技術(shù)對血清標(biāo)本中LMWP鑒定情況的比較Table 1 Comparison of methods used for serum peptidome enrichment and identification

4 結(jié)論與展望

綜上所述，面對易受水解酶影響的多肽組學(xué)，樣本準(zhǔn)備以及前處理過程需要建立標(biāo)準(zhǔn)程序，更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貫榕R床疾病診斷尋找潛在的分子標(biāo)志物。復(fù)雜樣本體系中大量高豐度蛋白質(zhì)的存在是肽組學(xué)發(fā)展面臨的最大挑戰(zhàn)，因此發(fā)展快速、有效、高通量、自動化的樣品前處理方法和技術(shù)勢在必行。目前富集LMWP的策略仍然延續(xù)高分子量或高豐度蛋白質(zhì)剔除方式，因此在樣品前處理前解離與高分子量或高豐度蛋白質(zhì)作用的LMWP對于提高LMWP的鑒定檢出非常重要。同時高分子量或高豐度蛋白質(zhì)的剔除將影響LMWP的回收率和重現(xiàn)性，最理想的方法是分離分析以及鑒定儀器獲得大的突破，使樣品無需經(jīng)過任何前處理就可獲得LMWP的信息。

上述肽組學(xué)樣品前處理方法和技術(shù)有各自的特點，為擴(kuò)大LMWP的檢測范圍可以任意組合使用。同時針對其他后修飾內(nèi)源性多肽(乙?；?、甲基化等）的分析，目前仍需要發(fā)展新的方法和技術(shù)。面對新方法和技術(shù)大量涌現(xiàn)的局面，如何將新方法和新技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化并商業(yè)化也是肽組學(xué)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展面臨的問題。

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