張 健，洪堅平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷030801）

除了施用化學(xué)磷肥以外，施用能夠分解土壤中難溶態(tài)磷的解磷細菌肥料，使其在作物根際形成一個磷素供應(yīng)較充分的微區(qū)[2]，從而改善作物磷素營養(yǎng)，提高作物的生物量和產(chǎn)量[3]，也是一個重要途徑。而微生物肥料或菌劑能使失去微生物活性的土壤重新建立和恢復(fù)土壤微生物體系[4-5]，開展解磷高效微生物的研究與應(yīng)用，對于挖掘土壤磷資源的利用潛力、節(jié)約磷肥投入、降低生產(chǎn)成本、保護我國磷礦資源和農(nóng)業(yè)高效持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和實踐意義[6]。

磷細菌的解磷變量是在活細胞的作用下變化的，動力學(xué)要研究這種變化規(guī)律以及各種條件對這些變量變化速度的影響以及影響其速率的各種因素，從而獲得相關(guān)信息，可反映細胞適應(yīng)環(huán)境變化的能力[7]。這一研究有助于我們更加深入地認識和掌握磷細菌菌肥對活化土壤、增加磷營養(yǎng)的可給性方面的研究[8]。磷細菌單菌株的解溶磷效果比較單一，而且效果相對有限，但目前，磷細菌群的研究相對較少。

本試驗將從石灰性土壤中分離鑒定出的5種磷細菌進行組建，通過建立化學(xué)動力學(xué)方程對組建的解磷菌群進行動力學(xué)研究，從而得到不同磷細菌群解磷動力學(xué)曲線和動力學(xué)方程，旨在為磷細菌生物肥料更好地被應(yīng)用于生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗所用菌株為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物實驗室從石灰性土壤中分離鑒定出的5種磷細菌，即有機磷細菌：蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、巨大芽孢桿菌（有機）（Bacillus megaterium）、黃桿菌（Flavobacterium）；無機磷細菌：假單胞菌（Pseudomonas）、巨大芽孢桿菌（無機）（Bacillus megaterium）。

1.2 菌株培養(yǎng)基[8]

無機磷細菌培養(yǎng)基：葡萄糖10g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·g，蒸餾水1 000 mL。

有機磷細菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，蒸餾水1 000 mL，蛋黃液30 mL（無菌生理鹽水與雞蛋黃1∶1配制），調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4。

1.3 試驗設(shè)計

根據(jù)菌種類型組建的6個磷細菌群分別為：G1.蠟狀芽孢桿菌＋巨大芽孢桿菌（無機）），G2.蠟狀芽孢桿菌＋假單胞菌；G3.黃桿菌＋巨大芽孢桿菌（無機）；G4.黃桿菌＋假單胞菌；G5.巨大芽孢桿菌（有機）＋巨大芽孢桿菌（無機）；G6.巨大芽孢桿菌（有機）＋假單胞菌。

2008年9月底的一天，有個客戶開了一輛銀灰色的凱迪拉克駛?cè)霃S區(qū)，正值下班時間，許多人都駐足觀看，就連平素高傲的副總裁的女兒方勛梅也發(fā)出了一聲贊嘆：“哇，凱迪拉克！”程曉暗戀方勛梅由來已久，只因門戶懸殊，他只有將自己的白日夢安放在姥姥家了。現(xiàn)在聽到方勛梅對凱迪拉克如此景仰，程曉的心久久不能平靜。他在網(wǎng)絡(luò)上把能讓方勛梅發(fā)出驚嘆的那輛凱迪拉克型號搜索了出來：它線條俊朗剛毅，身姿優(yōu)雅華貴，顏色明麗誘人，是凱迪拉克3.6L運動型，報價68.86萬元!

1.4 試驗方法

1.4.1 不同磷細菌群解磷動力學(xué)曲線的建立 將50 mL培養(yǎng)基（有機磷細菌和無機磷細菌各25 mL）裝入100 mL三角瓶中，加0.5 g磷礦粉，每瓶接磷菌群1 mL，共16瓶，30℃搖床培養(yǎng)。每隔24 h隨機取出2瓶，共培養(yǎng)8 d，分別取菌液測定速效磷含量和活菌數(shù)量，測定結(jié)果取其平均值。

1.4.2 不同磷礦粉量對磷細菌群轉(zhuǎn)化有效磷的影響 將50 mL培養(yǎng)基（有機磷細菌和無機磷細菌各25 mL）裝入100 mL三角瓶中，分別加入0.063，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 磷礦粉，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，5 d后取出，測定菌液速效磷含量，測定結(jié)果取其平均值。同時以未接菌的含磷礦粉培養(yǎng)基為空白對照（CK）。

1.5 測定項目及方法

有效磷的測定采用鉬藍比色法[9-10]；全磷的測定采用H2SO4-HClO4消煮鉬藍比色法[9]；細菌菌數(shù)的測定采用平板計數(shù)法[10]；磷細菌群解磷動力學(xué)方程的建立，采用Monod方程的非結(jié)構(gòu)模型和發(fā)酵動力學(xué)中的生長關(guān)聯(lián)型模型及其數(shù)學(xué)擬合法[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷細菌群解磷動力學(xué)曲線的建立

以時間為橫坐標(biāo)、有效磷量為縱坐標(biāo)，得到各個解磷菌群解磷動力學(xué)曲線如圖1所示。其反映了各菌群的解磷能力對時間的依賴關(guān)系。由圖1可知，隨著解磷時間的延長，所有磷細菌群處理下的有效磷數(shù)量不斷增加，尤其在前5 d，增加率較大，5 d后增加率趨于平緩。這可能是由于菌體將部分無機磷轉(zhuǎn)化為菌體中的結(jié)構(gòu)磷所致。鄭傳進[11]研究得出，巨大芽胞桿菌對無機磷中磷的釋放在第5天和第7天達到最大值，以后漸達平衡。G3（黃桿菌＋巨大芽孢桿菌（無機））的解磷能力相對其他菌群處理較高，是本試驗所需的最佳組合，說明黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無機）有較好的協(xié)同作用，這是由于5 d后巨大芽孢桿菌解磷能力下降，而黃桿菌的解磷能力沒有明顯下降[3]，所以，這2種解磷菌在發(fā)揮最大解磷能力的時間上互相補充，并且巨大芽孢桿菌和黃桿菌所釋放的磷酸酶和有機酸能互相協(xié)同螯合金屬離子，使難溶磷溶解出來[12]。

2.2 不同培養(yǎng)時間對不同磷菌群活菌數(shù)的影響

從表1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，各解磷菌群處理的活菌數(shù)均有所增加，其中，G3處理的活菌數(shù)增加最快，G2，G5處理次之。

表1 不同處理的磷細菌活菌數(shù) ×107個/mL

各菌群隨時間變化的磷細菌數(shù)量和有效磷形成量如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，磷細菌群菌體生長量與有效磷的產(chǎn)生量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，即有效磷與菌群活菌數(shù)均隨培養(yǎng)時間的延長而有所增加。

對于磷細菌來說，提高解溶磷的效果，最主要是通過增加磷細菌的數(shù)量來實現(xiàn)。磷細菌生物肥料含菌數(shù)一般為108～109個/g菌肥，通過施用磷細菌菌肥可增加土壤內(nèi)磷細菌數(shù)量，實現(xiàn)土壤有效磷增加的目的。另外，使得磷細菌獲得較高的生長速率也是增加磷細菌數(shù)量的有效途徑，也可以達到提高磷溶解速度的目的。Breet等[13]研究指出，植物和細菌的生長動力學(xué)相互關(guān)聯(lián)，因為他們的生長被同一種營養(yǎng)源限制，主要是有效磷。從圖2還可以看出，培養(yǎng)初期，磷細菌剛接種到培養(yǎng)基中，處于適應(yīng)期，此時有少量有效磷存在（這些磷源可供磷細菌生長）；適應(yīng)期過后，磷細菌快速生長進入對數(shù)生長期，并在其生長代謝過程中迅速將無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷；隨著培養(yǎng)時間的延長，有效磷的含量也逐漸升高；培養(yǎng)中期磷細菌進入生長穩(wěn)定期，活菌數(shù)增長比較緩慢；到培養(yǎng)后期，磷細菌生長進入衰亡期，活菌數(shù)急劇下降，有效磷的含量穩(wěn)定在一定的水平。劉麗麗[14]研究指出，當(dāng)磷細菌生物肥施入田間時，在磷細菌和植物根系形成的微生態(tài)中，植物根部的脫落物和分泌物不斷地向磷細菌提供營養(yǎng)，加速其生長，而解磷反應(yīng)的產(chǎn)物不斷地被植物吸收，根際微生態(tài)中的溶磷動力學(xué)的平衡點向形成產(chǎn)物的方向移動，從而刺激植物快速生長。微生物生態(tài)學(xué)家認為，土壤內(nèi)的微生物一般來說是處于饑餓狀態(tài)，外界提供營養(yǎng)的情況會很大程度上影響微生物的生長，所以，當(dāng)磷細菌生物肥料中磷細菌在植物根部定植下來以后，對磷細菌來說植物提供的營養(yǎng)條件是限制其生長的主要因素[15-16]。

2.3 不同磷細菌群解磷動力學(xué)方程的建立

從表2可以看出，隨著提供的底物磷礦粉量的增多，不同磷細菌群轉(zhuǎn)化有效磷的數(shù)量在增加。說明在一定的范圍內(nèi)，提供的底物磷礦粉越多，磷細菌群轉(zhuǎn)化有效磷的數(shù)量就越多。以磷礦粉量為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液中的有效磷量為縱坐標(biāo)，可得到菌群的無效磷轉(zhuǎn)化曲線，以G1為例，如圖3（曲線A）所示。

表2 不同磷礦粉量對磷細菌群轉(zhuǎn)化有效磷的影響 mg/L

由無效磷轉(zhuǎn)化動力學(xué)曲線（圖3）得到動力學(xué)方程:

式中，Y為有效磷量，X為細菌濃度，a為轉(zhuǎn)化常數(shù)，b為特征常數(shù)。

由（1）得：11.83＝alg1＋b

由（2）得到：a＝4.74，b＝11.83。

即G1的無效磷轉(zhuǎn)化有效磷的動力學(xué)方程為：

方程經(jīng)擬合驗證：

由圖3可知，用試驗數(shù)據(jù)與模型計算值進行驗證比較，模型計算（曲線B）與試驗結(jié)果（曲線A）擬合良好。

同樣方法得出，G2無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝3.7lgX＋13.65；G3無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝28.29lgX＋45.99；G4無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝9.13lgX＋18.92；G5無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝27.62lgX＋45.99；G6無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝3.39lgX＋12.40。

從6個菌群無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程可以看出，G3方程中轉(zhuǎn)化系數(shù)和特征常數(shù)的值最大，說明G3（黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無機）的組合）處理的無效磷轉(zhuǎn)化有效磷的能力最強。模型正確地反映了磷細菌群的產(chǎn)物形成過程及其動力學(xué)機制[17]，說明通過對初選出的6組高效解磷菌群進行比較，得出黃桿菌和巨大芽胞桿菌對無效磷的轉(zhuǎn)化有很好的協(xié)同作用，這2種磷細菌相互促進各種產(chǎn)物的形成，對有效磷的增加有很好的效果。

Sperber等[18]研究結(jié)果表明，根際微生物的活性及其群落結(jié)構(gòu)對植物磷素營養(yǎng)影響很大，在這個過程中，磷細菌群可以將無效磷轉(zhuǎn)化為植物營養(yǎng)磷，并且隨磷細菌數(shù)量增加而增加，隨土壤中全磷特別是無效磷（磷礦粉）量增加而增加；在施用磷細菌生物肥后，將對活化土壤、增加磷營養(yǎng)的可給性帶來很大改善[11]；有些種類的磷細菌除了具有解磷活性，在植物根際還能夠分泌一定量的植物激素，對作物生長具有刺激作用[19]。因此，大力推廣使用磷細菌生物肥料能克服大量使用化肥所帶來的環(huán)境污染問題，并通過微生物的修復(fù)作用，可改善土壤環(huán)境、促進持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，各磷細菌群處理下的有效磷數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長不斷增加，尤其在前5 d的增加率較大，5 d后增加率趨于平緩。在不同磷水平下，底物濃度越高，磷細菌群的轉(zhuǎn)化有效磷量越大，其中，黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無機）組合轉(zhuǎn)化有效磷含量相對較高，無效磷（磷礦粉）轉(zhuǎn)化動力學(xué)方程為：Y＝28.29lgX＋45.99，且在磷礦粉為2 g時，有效磷含量最高，達到50.24 mg/L。

本試驗中的磷細菌群是由2種類型的磷細菌組成，其內(nèi)部作用機理比單菌株的解溶磷機理更為復(fù)雜，試驗通過綜合各測定指標(biāo)得出，黃桿菌和巨大芽孢桿菌（無機）的組合有較高的生長速率，對無效磷的轉(zhuǎn)化起到相對較好的作用，這為更好地研制磷細菌生物肥料提供了理論依據(jù)。

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