王文斌，王 琳

（山西農業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

紫花苜蓿是世界上種植面積最大，應用最為廣泛的豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱，產業(yè)化市場前景廣闊[1-3]。其不僅富含蛋白質、多種維生素和礦物質[4-6]，而且其發(fā)達的根系還具有防風固沙和保持水土等重要的生態(tài)功能[7-8]。但是干旱、鹽漬等多種逆境限制了它的推廣和應用。

國內外已有將外源基因導入紫花苜蓿獲得再生植株的報道，而異源目的基因的高效遺傳轉化有賴于植物高頻再生體系的建立[9-10]。在植物遺傳轉化的研究中，通過愈傷組織再生植株的方法，有利于保持原有品種的優(yōu)良性狀，再通過轉移控制特定性狀的目的基因，從而達到改良其品質或其他特性的目的。

本試驗以新疆大葉和新牧一號苜蓿下胚軸、子葉為材料，研究不同基因型、外植體、培養(yǎng)基及激素配比對其愈傷組織誘導和分化的影響，旨在建立針對這2個品種的高頻轉化受體系統(tǒng)，為苜蓿的遺傳轉化奠定堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿品種為新疆大葉（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）、新牧一號（Medicago sativa L.cv.Xinmu No.1），均由新疆農業(yè)大學草業(yè)工程學院張博教授惠贈。試驗采用5 d苗齡的紫花苜蓿無菌苗子葉和下胚軸為外植體。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑 SH鹽，使用濃度為3183.25mg/L；SH維生素，使用濃度為1 010.5 mg/L；MS，含MS鹽和維生素，使用濃度為 4 405.19 mg/L；2，4-D，用少量95%乙醇溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；KT，BAP，NAA，IBA，分別用少量 1 mol/L KOH溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；以上試劑均購自Sigma公司。

1.2.2 基本培養(yǎng)基 試驗以MS（含MS鹽和MS維生素）和SH（含SH鹽和SH維生素）為基本培養(yǎng)基；進行愈傷誘導、分化和生根時，分別添加不同濃度的植物生長激素和細胞分裂素，附加30 g/L蔗糖、7 g/L植物瓊脂；1/2 MS培養(yǎng)基中，MS成分減少1/2，其他成分不變。所有培養(yǎng)基的pH值均為5.7，121℃高壓滅菌15 min，分裝備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子消毒及無菌苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿種子，簡單沖洗1 min，轉入無菌離心管，每管約為100粒種子，70%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次；然后在0.5%NaClO中消毒5 min，再用無菌水沖洗7～8次。接種于無激素的1/2 MS培養(yǎng)基，封口膜密封，（25±2）℃暗培養(yǎng) 2 d，再于（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）及16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.2 愈傷組織誘導 選取5 d苗齡的健康幼苗，分別切取下胚軸（下胚軸切成0.5 cm左右的小段）和子葉（子葉沿靠近子葉柄的部位橫切，去距葉柄葉面積的1/3，余2/3面積的子葉），作為愈傷誘導的外植體，分別接種于不同愈傷誘導培養(yǎng)基。供試培養(yǎng)基及激素配比為：MS＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；SH＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；MS＋2 mg/L 2，4-D ＋1 mg/L BAP＋4 mg/L NAA[11-12]。每 90 mm（直徑）×15 mm（高）的培養(yǎng)皿接種20塊，每種外植體、每個激素水平設置80～100塊，16 h/8 h光周期培養(yǎng)，溫度（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）。每隔2周繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)基同愈傷誘導培養(yǎng)基。誘導4周后，觀察愈傷組織生長狀況，并統(tǒng)計出愈數，計算出愈率。

1.3.3 愈傷組織分化 下胚軸經愈傷誘導培養(yǎng)4周后，按愈傷組織的不同來源，各取60～80塊，分別接入MS和SH（均添加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）芽分化培養(yǎng)基，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養(yǎng)皿接種10塊，16 h/8 h光周期培養(yǎng)，（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）。每2周繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)基同芽分化培養(yǎng)基。誘導8周后，統(tǒng)計再生芽的愈傷組織數，計算分化率。

1.3.4 根的誘導 不同來源的愈傷組織在芽分化培養(yǎng)基上誘導30～50 d后可生成芽，待無根小苗長至2～3 cm時，從基部切下，移入1/2 MS或1/2 MS＋1 mg/L IBA生根培養(yǎng)基上進行根的誘導，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養(yǎng)皿接種10個，培養(yǎng)條件同芽分化，觀察并統(tǒng)計生根情況。

1.3.5 擴繁及移栽 再生苗的擴繁培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基相同，切取抗性苗頂芽或帶1個腋芽的莖段接入擴繁培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同芽分化。觀察并統(tǒng)計生根情況。當再生的小植株出現3條以上健壯根時，稍打開培養(yǎng)皿蓋，室內鍛煉1～2 d后再將幼苗從培養(yǎng)皿中取出，小心用流水沖凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽于盛有花土的小花盆中，花土需經浸水過夜。最初3～5 d，盛裝小花盆的容器可遮上塑料薄膜以保持濕度，當小苗長出健壯莖葉時，可將其移入大花盆中。

1.4 測定項目及方法

出愈率＝產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%；分化率＝分化出芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%；生根率＝生根的植株數/接種的無根小苗數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養(yǎng)基對愈傷誘導的影響

試驗首先以新疆大葉下胚軸為材料，研究不同的基本培養(yǎng)基對愈傷誘導的影響，結果表明，接種到MS培養(yǎng)基（含2 mg/L 2，4-D）上培養(yǎng)4周后，出愈率達86.5%；而接種到SH培養(yǎng)基（含2 mg/L 2，4-D）上時，愈傷組織開始發(fā)生的時間相對較遲，但最終出愈率為83.5%，與在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)之間無明顯差異。

2.2 不同基因型、外植體和激素配比對愈傷誘導及其生長狀況的影響

從表1可以看出，在MS并附加各種激素的培養(yǎng)基上，無論對于下胚軸還是子葉外植體，2種基因型苜蓿間出愈率均沒有明顯差異；而在SH培養(yǎng)基上，新牧一號下胚軸和子葉的出愈率均高于新疆大葉，但基因型間愈傷組織的形態(tài)特征及生長速率沒有明顯差別。

激素配比對愈傷組織誘導影響較大。在MS和SH這2種培養(yǎng)基上，KT濃度為0.2 mg/L時，出愈率達到最大，下胚軸出愈率92.7%～98.5%，子葉出愈率80.4%～85.6%。在含2 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L BAP和4.0 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，下胚軸和子葉的出愈率明顯小于在MS或SH培養(yǎng)基上附加0.2 mg/L KT時的出愈率，愈傷組織呈黃色團塊狀，質地堅硬。下胚軸和子葉不同外植體在相同培養(yǎng)條件下的愈傷組織誘導率差異較為明顯。在各種培養(yǎng)基及激素配比下，下胚軸愈傷啟動時間短，在第3～5天時，就開始有愈傷組織形成，而子葉最早要到第7天，而且下胚軸的出愈率明顯高于子葉。

表1 不同基因型、外植體和激素配比對愈傷誘導的影響

綜合評價，MS＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT 培養(yǎng)基適用于新疆大葉下胚軸和子葉的愈傷誘導，SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT適用于新牧一號。

2.3 不同愈傷組織來源及培養(yǎng)基對愈傷組織分化的影響

為了進一步比較不同培養(yǎng)基、激素及基因型對下胚軸外植體再生的影響，選擇了4個試驗組合（表2）分析其再生率。

表2 不同的培養(yǎng)基組合

從MS和SH（均附加2 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT）培養(yǎng)基中分別挑選不同基因型下胚軸來源的新鮮淡綠色愈傷組織，接種到MS和SH（附加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）的培養(yǎng)基上，進行愈傷組織的分化培養(yǎng)。在2種培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周后，愈傷組織表面均開始出現綠色芽點（圖1-A），并逐漸轉變?yōu)槌墒斓呐郀铙w（圖1-B，C）。繼續(xù)培養(yǎng)4～6周后，部分愈傷組織分化出芽（圖1-D）。

從分化培養(yǎng)8周后統(tǒng)計的分化率結果（表3）可以看出，相同來源的愈傷組織在MS培養(yǎng)基上的分化率均高于SH培養(yǎng)基，表明培養(yǎng)基類型對愈傷組織的分化影響較大，添加1 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基更加適宜不定芽誘導。

表3 不同基因型下胚軸在不同組合條件中的再生率

2.4 生根、擴繁及移栽情況

在愈傷組織分化誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)30～50 d后，將長至2～3 cm的再生芽從愈傷組織基部切下，轉入不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基，7～10 d即可生根，生根率達100%。選取抗性苗頂芽或帶1個腋芽的莖段接入不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基誘導生根，結果發(fā)現，在擴繁培養(yǎng)第2代后，生根過程明顯推遲至第15～20天，而且多為短而粗的主根，很少出現不定根。為此，向1/2 MS培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA，生根過程略有提前，并有不定根形成（圖1-E）。將出現3條以上健壯根的再生小植株經室內鍛煉后移入小花盆（圖1-F），成苗率達100%。

2.5 不同培養(yǎng)基及激素組合下植株的比較

由表3還可知，對于新疆大葉而言，盡管組合Ⅰ，Ⅱ中的出愈率略高于組合Ⅲ，Ⅳ，但分化率明顯降低，并由此導致再生率降低，下胚軸再生率最高的為組合Ⅲ，達46.54%；而新牧一號下胚軸在組合Ⅲ，Ⅳ中的出愈率及分化率均高于組合Ⅰ，Ⅱ，所以再生率也顯著提高，其中組合Ⅲ的再生率達54.96%。

3 討論與結論

多數研究認為，基因型對苜蓿的再生能力影響較大。馬海燕等[13]研究表明，以下胚軸為外植體，在MS＋2 mg/L 2，4-D＋2 mg/L NAA＋1 mg/L KT 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周內，新疆大葉和新牧一號的出愈率均達92%以上，且新疆大葉略優(yōu)于新牧一號；至4周時，二者愈傷誘導無顯著差別，在附加15 mg/L GSH＋6 mg/L ABA的MS分化培養(yǎng)基上，新疆大葉的分化率高于新牧一號。而蘭研[14]的研究則認為，以葉片為外植體，在同樣的培養(yǎng)基上新疆大葉出愈率較新牧一號高，但在MS＋4 mg/L KT的分化培養(yǎng)基上，新牧一號的綠點率及成苗率高于新疆大葉?？梢姡荒芎唵闻袛喽咴偕芰Φ拇笮?，所謂再生能力的強弱是基于其所處的培養(yǎng)條件。本試驗中，盡管新疆大葉和新牧一號的再生能力也存在一定差異，如在SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT培養(yǎng)基上新疆大葉的出愈率略高于新牧一號，而在其他培養(yǎng)基上新牧一號則高于新疆大葉，但差異不顯著，2種基因型下胚軸來源的愈傷組織的分化能力也無明顯差異。由此可見，在本試驗中，基因型對苜蓿的再生能力并沒有顯著影響，但需要說明的是，這個結論的得出基于試驗中所采用的相同的外植體、培養(yǎng)基類型及激素配比這個前提條件。

在植物離體培養(yǎng)的過程中，外植體的內源激素水平不斷變化，在培養(yǎng)基中添加不同種類、不同濃度的生長調節(jié)物質可以影響內源激素的水平，從而影響外植體的生長狀況，控制細胞脫分化和形態(tài)建成[15]。一些試驗結果顯示，低濃度的細胞分裂素能夠提高愈傷組織的誘導率[16]。在本試驗中，也得到了類似的結果，在愈傷組織的培養(yǎng)階段，KT能輔助2，4-D發(fā)揮更好的效果，0.2 mg/L是KT對于下胚軸愈傷組織誘導及生長最適宜的濃度，過高濃度的KT反而會降低愈傷組織的誘導率。這也與潘競麗等[16]的研究以及王涌鑫等[17]對保定苜蓿的研究結果相一致。但肖燕等[12]以2mg/L2，4-D＋1mg/L BAP＋4 mg/L NAA的激素配比成功從新疆大葉和新牧一號下胚軸誘導出愈傷組織，且培養(yǎng)4周時出愈率達100%；而本試驗中盡管通過該培養(yǎng)基也誘導出愈傷組織，但出愈率較低，最高出愈率僅為86.7%，愈傷組織狀況也不如附加2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT的培養(yǎng)基，這可能是由于試劑不同所造成的，具體的原因還有待進一步分析。借鑒馬暉玲等[18]的研究，本試驗中愈傷組織在含1.0mg/LBAP和0.3 mg/L NAA的培養(yǎng)基上也成功分化出芽，且分化率最高達到55.8%。

幾乎苜蓿所有器官或組織都可以作為外植體，但對于不同的基因型、在不同的培養(yǎng)條件下，合適的外植體選擇也是決定再生體系成功的一個關鍵因素。近年來，在紫花苜蓿再生體系建立的研究中，子葉和下胚軸是較常用的外植體[12，19-21]，且下胚軸的愈傷誘導率高于子葉。本試驗結果也表明，無論是對于不同的基因型，還是不同的培養(yǎng)基、不同濃度的KT，下胚軸的愈傷誘導率均明顯高于子葉，下胚軸最高出愈率達98.5%，子葉最高為85.6%，而且下胚軸愈傷啟動時間短，愈傷質量較好。

愈傷組織的誘導和分化對培養(yǎng)基的需求是不同的。在愈傷組織誘導階段，新疆大葉在MS培養(yǎng)基上的出愈率略優(yōu)于SH培養(yǎng)基，新牧一號則相反，但是愈傷組織的分化率結果證明，來源于SH培養(yǎng)基的愈傷組織分化能力要明顯高于MS培養(yǎng)基。在愈傷組織分化階段，含相同激素的MS分化培養(yǎng)基要優(yōu)于SH培養(yǎng)基。受不同培養(yǎng)基的影響，植株的再生率也出現顯著差異。由此可見，對于2種苜蓿而言，SH更加適宜愈傷組織的誘導，而MS培養(yǎng)基更利于愈傷組織的分化。

綜上所述，適用于2種苜蓿愈傷組織誘導、分化及生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別為SH（附加2 mg/L 2，4-D 和 0.2 mg/L KT），MS（附加 1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）和 1/2 MS（擴繁時附加 1 mg/L IBA）。

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