丁文秀，李 震，李敬忠，徐玉新*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，山東 泰安 271008;2.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000;3.泰安市泰山區(qū)環(huán)境保護(hù)局，山東 泰安 271000)

1 前言

20世紀(jì)40年代來，抗生素作為飼料添加劑及獸藥來預(yù)防治療疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)［1］。然而，大量使用抗生素使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性［2］，動(dòng)物體內(nèi)殘留的抗生素通過食物進(jìn)入人體［3］，病原菌的抗藥性對(duì)人體健康存在威脅［4］。日本和美國(guó)等對(duì)飼料中添加抗生素做出嚴(yán)格的限制［5］。

具有防病、促生長(zhǎng)的飼料添加劑除抗生素外，還有微生態(tài)制劑［6］。微生態(tài)制劑是根據(jù)微生態(tài)理論，從動(dòng)物體內(nèi)外分離的對(duì)動(dòng)物有益微生物，經(jīng)特殊加工制成含有益微生物及其代謝產(chǎn)物的活菌制劑［7］。微生態(tài)制劑有無耐藥性、無殘留特點(diǎn)而成為替代抗生素的良好選擇。本文突破以往微生態(tài)制劑只注重營(yíng)養(yǎng)作用觀點(diǎn)，從抗菌性能評(píng)價(jià)微生態(tài)菌株，研究飼用抗生素的替代品，減少使用抗生素所引起的食品安全、病原菌耐藥性和環(huán)境問題。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 菌株 芽孢桿菌篩選試驗(yàn)前處理菌株:N9、枯草芽孢桿菌(媽咪愛)、地衣s、冷1#、納豆1、納豆4、BT123、蠟樣芽孢桿菌。

候選菌株:納豆2、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌B7348、丁酸梭菌。

芽孢桿菌初篩病原性指示菌:豬大腸桿菌1565、藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌。

芽孢桿菌復(fù)篩病原性指示菌:雞大腸桿菌1565、豬大腸桿菌2116、雞傷寒沙門氏菌C79－20、雞白痢沙門氏菌C79－13、豬大腸桿菌249、金黃色葡萄球菌。

乳酸菌篩選試驗(yàn)菌株:嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌(LP)、戊糖片球菌(PP)、嗜熱鏈球菌、乳酸鏈球菌、RDH 乳球菌。

乳酸菌篩選試驗(yàn)病原性指示菌:雞大腸桿菌1565、豬大腸桿菌2116、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌N9、地衣芽孢桿菌s、B7348(實(shí)驗(yàn)室保存菌株)。

2.1.2 培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

2.1.3 試驗(yàn)器材 XSS－600 顯微鏡，500 型恒溫培養(yǎng)箱，JHT 型凈化工作臺(tái)，LD5－2A 型離心機(jī)，pHS－3C 型精密pH 計(jì)，BC－163K 型冰箱，GUJS－7A 型實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐，TCYQ 型恒溫振蕩器，LD4－40 型離心機(jī)，F(xiàn)A1004 型電子天平，UV－2000 型紫外可見分光光度計(jì)等。

2.1.4 其他材料 海蘭褐雛公雞，AA+白羽肉雞，乳酸菌發(fā)酵物及抗生素氧氟沙星(2%)、阿散酸。安全性試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧(玉米64%，豆粕28%，魚粉3%，蛋雞預(yù)混料5%)。免疫效率試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧(玉米59.67%，大豆粕35%，石粉1.4%，磷酸氫鈣1.5%，蛋氨酸0.1%，賴氨酸0.1%，植物油1.6%，食鹽0.3%，氯化膽堿0.1%，肉雞－微量0.2%，肉雞－多維0.03%)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 芽孢桿菌初篩 (1)試驗(yàn)菌株前處理:芽孢桿菌屬菌株用培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，3.0%黃豆餅粉，0.2%蛋白胨，0.1%NaCl，0.5% (NH4)2SO4，0.6%CaCO3，0.6%MgSO4)30 ℃、pH為7.2～7.5 下液態(tài)培養(yǎng)48 h 后，芽孢生成率達(dá)10%可用于試驗(yàn)。按無菌操作取試驗(yàn)菌培養(yǎng)液10000 rpm 離心10 min，取上清液待用。病原性指示菌由培養(yǎng)基(0.2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5%牛肉膏)在pH 7.0，37 ℃下液態(tài)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)所得病原性指示菌試驗(yàn)前稀釋100 倍。(2)微生態(tài)制劑菌株的篩選抑菌試驗(yàn):每個(gè)平板上放置牛津杯，杯間距離相等。取雙層培養(yǎng)基平板，每個(gè)小杯加滿上清液，培養(yǎng)36 h 觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。

2.2.2 芽孢桿菌復(fù)篩 通過初篩，確定復(fù)篩范圍，增加候選菌株作為篩選來源。對(duì)初篩中有抑菌作用的菌株培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同初篩。培養(yǎng)后的芽孢桿菌，經(jīng)10000 rpm 離心10 min，取上清液，置4 ℃保存?zhèn)溆?。選取指示菌在試驗(yàn)前經(jīng)24 h 培養(yǎng)，660 nm 測(cè)定光密度值。試驗(yàn)前稀釋100 倍，以光密度值0.2～0.3為宜。復(fù)篩菌株抑菌試驗(yàn)同初篩。

2.2.3 pH 值對(duì)芽孢桿菌抑菌效果影響 試驗(yàn)用菌株(地衣s和芽孢桿菌B7348)培養(yǎng)條件同復(fù)篩，結(jié)束培養(yǎng)后，芽孢生成率達(dá)10%可用于試驗(yàn)。按無菌操作將發(fā)酵液pH 調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 離心10 min，取上清液待用?？瞻着囵B(yǎng)基pH 調(diào)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，10000 rpm 離心10 min，取上清液待用。

2.2.4 復(fù)篩菌株的產(chǎn)酶性能試驗(yàn) 用福林法測(cè)定B7348、冷1#和N9 的中性蛋白酶活力。

2.2.5 乳酸菌的篩選 乳酸菌用MRS 液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，10000 rpm 離心分離菌體和上清液。指示菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)24 h。用牛津杯法測(cè)定各乳酸菌菌株對(duì)指示菌抑菌效果。

2.2.6 乳酸菌耐受試驗(yàn) (1)乳酸菌酸耐受試驗(yàn):用100 mL 鹽水瓶裝量培養(yǎng)基100 mL，接種LP、嗜酸乳桿菌、PP 試驗(yàn)菌株，37℃搖床低速培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液用HCl 調(diào)pH為2.0、2.5、3.0，37℃培養(yǎng)，每隔0.5h取樣計(jì)數(shù)。

(2)乳酸菌膽鹽耐受試驗(yàn):用100 mL 鹽水瓶裝量培養(yǎng)基100 mL，接種上述三種菌株，37℃搖床低速培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液豬膽鹽濃度調(diào)成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃培養(yǎng)10 min，取樣計(jì)活菌總數(shù)。

2.2.7 后備菌株代謝產(chǎn)物中有效抑菌成分初步分析 用SDS－PAGE 方法分析。膠濃度為15%，樣品上樣量20μL，Maker 上樣量10μL。芽孢桿菌菌體、芽孢桿菌培養(yǎng)液、芽孢桿菌培養(yǎng)液10000 rpm 離心5 min，取上清液。加至1、2、3 泳道分析。乳酸菌菌體、乳酸菌培養(yǎng)液、乳酸菌培養(yǎng)液10000 rpm 離心5 min，取上清液。加至4、5、6 泳道分析。

2.2.8 菌種安全性試驗(yàn) 將B7348 發(fā)酵后噴霧干燥，制成噴干菌粉。將LP－11 發(fā)酵后真空冷凍干燥，制成凍干菌粉。對(duì)兩種菌粉進(jìn)行計(jì)數(shù)。分別稀釋成含1×108個(gè)活菌菌粉。將供試菌種加到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)日糧中，添加比例為0.5‰(1 組)、1‰(2 組)、2‰(3 組)、5‰(4 組)、10‰(5 組)。

試驗(yàn)動(dòng)物以基礎(chǔ)日糧預(yù)飼一周，稱重后隨機(jī)分十個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，其中五個(gè)組添加B7348，為7(1)、7(2)、7(3)、7(4)、7(5)組;五個(gè)組添加LP－11，為N(1)、N(2)、N(3)、N(4)、N(5)組;對(duì)照組不加菌粉，每組樣本20 只。經(jīng)兩周生長(zhǎng)試驗(yàn)，稱重計(jì)算增重率并解剖觀察器官。

2.2.9 菌種免疫效率試驗(yàn) AA+白羽肉雞120 只，隨機(jī)均分為四組。一組空白(Ck 組:不添加菌種和抗生素)，兩組添加供試菌種(Ⅰ、Ⅱ組為添加不同劑量供試菌種組)，一組添加抗生素(Ⅲ)。使用雞沙門氏菌染毒并觀察發(fā)病率和病死率。各試驗(yàn)組日糧組成及含量見表1。

表1 各試驗(yàn)組日糧組成及含量Table 1 The composition and content of diet group

3 結(jié)果與分析

3.1 芽孢桿菌初篩

芽孢桿菌初篩結(jié)果見表2。

表2 芽孢桿菌初篩結(jié)果Table 2 The results of Bacillus early sifting

初篩試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):枯草芽孢桿菌(媽咪愛)、納豆1 對(duì)采用的指示菌沒有明顯抑制作用;N9、地衣s、冷1#、納豆4、BT123 至少對(duì)兩種指示菌具有明顯抑制作用，蠟樣芽孢桿菌只對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用。

3.2 芽孢桿菌復(fù)篩

芽孢桿菌復(fù)篩結(jié)果見表3。

表3 10株芽孢桿菌對(duì)指示菌的抑菌效果(單位:mm)Table 3 The antibacterial effect of 10 strains of bacillus instructions(unit:mm)

表3 有5株芽孢桿菌對(duì)指示菌產(chǎn)生相對(duì)較強(qiáng)的抑菌作用，即冷1#、地衣s、納豆2、N9、7348。

表4 復(fù)篩后五株芽孢桿菌的抑菌圈(單位:mm)Table 4 Five strains bacillus bacteriostatic circle after seconf sifting(unit:mm)

表4:5株芽孢桿菌對(duì)6 種指示菌有不同程度的抑菌作用，枯草芽孢桿菌B7348 對(duì)革蘭氏陽性致病菌－金黃色葡萄球菌，抑制效果十分明顯。

3.3 pH 值對(duì)芽孢桿菌抑菌效果影響

(1)不同pH 值對(duì)地衣s 抑菌效果的影響

以抑菌圈平均值(X)表示不同pH 值對(duì)地衣s 的抑菌效果，見表5。

表5 pH 值對(duì)地衣s 抑菌效果的影響(mm)Table 5 The antibacterial effect about pH on Bacillus Licheniformis s(mm)

在所設(shè)的pH 值下:地衣s 對(duì)藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌均具有不同程度的抑菌作用，而且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力比對(duì)藤黃八疊球菌強(qiáng);而對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌無抑菌作用。

(2)不同pH 值對(duì)B7348 抑菌效果的影響

不同pH 值對(duì)B7348 抑菌效果以抑菌圈平均值(X)表示，見表6。

表6 pH 值對(duì)B7348 抑菌效果的影響(mm)Table 6 The antibacterial effect about pH on B7348(mm)

在所設(shè)pH 值下:B7348 對(duì)7 種指示菌有不同程度的抑菌效果;且對(duì)同一指示菌，B7348 抑菌效果沒有明顯差別。B7348 的抗菌性對(duì)所設(shè)pH 不敏感。芽孢菌結(jié)束培養(yǎng)后，pH為7.0 左右抑菌效果較好，培養(yǎng)無需調(diào)整pH 值。

3.4 復(fù)篩菌株的產(chǎn)酶性能試驗(yàn)

復(fù)篩菌株的產(chǎn)酶性能試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 中性蛋白酶測(cè)定結(jié)果Table 7 The determination result of neutral protease

表7:B7348 中性蛋白酶活力最高，中性蛋白酶活力可達(dá)140 U/mL，明顯高于其他2株篩選菌株。

3.5 乳酸菌的篩選

不同乳酸菌菌株對(duì)指示菌菌株的抑菌結(jié)果見表8。

表8 不同乳酸菌抑菌效果(單位:mm)Table 8 The bacteriostatic effect of different Lactic acid bacteria

表8:LP、嗜酸乳桿菌、PP 對(duì)指示菌中致病菌抑制效果較明顯且對(duì)芽孢菌的抑制相對(duì)較弱。

3.6 乳酸菌耐受試驗(yàn)

(1)乳酸菌的酸耐受試驗(yàn)

乳酸菌酸耐受試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 不同乳酸菌耐受結(jié)果(cfu/ml)Table 9 The result of acid tolerence about different Lactic acid bacteria

表9:該三種乳酸菌在pH 值為2.0 時(shí)，2 h 后不能耐受。相較于其他2株菌株，酸的耐受能力尤以植物乳桿菌最強(qiáng)。

(2)乳酸菌的膽鹽耐受試驗(yàn)。

乳酸菌膽鹽耐受試驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 不同乳酸菌膽鹽耐受結(jié)果Table 10 The result of cholate tolerance about different Lactic acid bacteria

表10:膽鹽對(duì)三株乳酸菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，在0.2%的膽鹽濃度下，活菌數(shù)仍然保持在108，在0.3%、0.4%和0.5%膽鹽濃度下活菌數(shù)呈梯度下降趨勢(shì)。但戊糖片球菌的耐受性比另兩株乳桿菌強(qiáng)。

通過篩選，考慮菌株抑菌性和生物特性，選擇芽孢桿菌B7348和植物乳桿菌LP－11為后備菌株。芽孢桿菌B7348 對(duì)革蘭氏陽性菌抑制效果較好，而植物乳桿菌LP－11 對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果明顯，聯(lián)合使用效果更佳。芽孢桿菌B7348和植物乳桿菌LP－11 是在現(xiàn)有菌株基礎(chǔ)上篩選得到，培養(yǎng)發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化，液體深層發(fā)酵過程中能達(dá)到109cells/ml和1010cells/ml。

3.7 后備菌株代謝產(chǎn)物中有效抑菌成分初步分析

芽孢桿菌B7348 SDS－PAGE 分析見圖1。乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析結(jié)果見圖2。

圖1 芽孢桿菌B7348 SDS－PAGE 分析Fig.1 The analysis on SDS－PAGE about Bacillus

圖2 乳酸菌LP－11 SDS－PAGE 分析Fig.2 The analysis on SDS－PAGE about Lactic acid bacteria

芽孢桿菌B7348 在8 kd 左右出現(xiàn)三條濃密的條帶，從分子量上分析，此三條帶均為小分子肽類物質(zhì)。其培養(yǎng)液上清及沉淀中出現(xiàn)此條帶，說明芽孢菌B7348 能分泌出這種活性小肽。對(duì)乳酸菌LP－11 的蛋白成分進(jìn)行分析，結(jié)果與芽孢桿菌相似。乳酸菌LP－11 主要成分分子量為3.5 kd 左右，說明該株乳酸菌主要抑菌物質(zhì)為分子量更小的抗菌肽類物質(zhì)。通過檢驗(yàn)抑菌活性，發(fā)現(xiàn)乳酸菌LP－11 有較好的抑制指示菌作用。

3.8 菌種安全性分析

飼喂試驗(yàn)的結(jié)果見表11。

表11 增重率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(%)Table 11 The experimental results of weight increasing rate

經(jīng)兩周飼喂后，雛雞生長(zhǎng)發(fā)育正常，觀察雛雞外觀及糞便未見異常。解剖學(xué)性狀未見異常，具體見圖3。

圖3 安全性試驗(yàn)部分臟器Fig.3 The part organs safety test

圖3:添加最高劑量B7348 的5 組的臟器與對(duì)照組相比未發(fā)現(xiàn)異常，初步斷定用于養(yǎng)殖動(dòng)物的飼喂是安全的。表11:7(2)7(3)7(4)7(5)N(1)N(3)N(4)等組增重率均高于對(duì)照組。

3.9 菌種免疫效率試驗(yàn)

肉雞染毒后指標(biāo)見表12。

表12 肉雞染毒后指標(biāo)Table 12 The index of chiken after poison attack

表12:對(duì)照組發(fā)病率和病程明顯高于其它各組。從發(fā)病率來看，第Ⅱ組、第Ⅲ組相同，低于第Ⅰ組。從病程來看，第Ⅱ組最短，第Ⅰ組和第Ⅲ組相同。病死率第Ⅱ組、第Ⅲ組為0。綜上所述，添加菌種的第Ⅱ組實(shí)驗(yàn)結(jié)果最好。

4 結(jié)論

篩選出的抑菌性芽孢桿菌B7348和乳酸菌LP－11 無論在菌種安全性還是在免疫效率方面有出色表現(xiàn)，兩者合理搭配可替代飼用抗生素在飼料中的使用。用兩株益生菌及其代謝產(chǎn)物，在提高抵抗力，減少發(fā)病率方面，已達(dá)到和超過飼用抗生素效果。微生態(tài)制劑有抗生素?zé)o法比擬的天然優(yōu)勢(shì)，將會(huì)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

［1］LEVY S B.Factors impacting on the problem of antibiotic resistance antimicrob［J］.Chemother，2002，49:25－30

［2］張麗芳，王占武，田洪濤，等.飼用微生態(tài)制劑的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用前景［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，9(1):104－106

［3］任作寶，王選慧.微生態(tài)制劑研究現(xiàn)狀與展望［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011，4:78－80

［4］周桂蓮，蔣宗勇，林映才.飼用抗生素在畜禽體內(nèi)殘留及消除規(guī)律研究進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2007，28(4):1－8

［5］溫劉發(fā).飼用抗生素替代品的研究開發(fā)趨勢(shì)與我國(guó)的對(duì)策［J］.中國(guó)動(dòng)物保健，2008，(114):85－91

［6］余伯良，周 健.飼料安全與人類健康［J］.糧食與飼料工業(yè)，2003，(9):1－3

［7］趙明娟，吳 凌，夏 成.微生態(tài)制劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2008，(1)35－37