曾祥華，楊 軍，田 浩，劉琳琳，胡 寧

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室視覺損傷與再生修復(fù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400030）

0 引言

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)是一種重要的生物化學(xué)檢測分析方法，具有檢測精度高、樣品不需標(biāo)記、不需分離純化、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測［1］等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域［2］。傳統(tǒng)的 SPR檢測裝置體積龐大、價(jià)格昂貴［3］，為了滿足越來越廣泛的檢測需求，便攜式、小型化SPR生物傳感器的研究得到了廣泛關(guān)注。其中，美國德州儀器（Texas Instruments，TI）公司生產(chǎn)的 Spreeta傳感器［4］最具代表性。該傳感器采用Kretschmann結(jié)構(gòu)，光源采用近紅外光LED，檢測器采用線陣硅光二極管，體積非常小。但是，該傳感器只是一個(gè)獨(dú)立傳感模塊，需要另外配備流通系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集模塊以及控制電路等。

因此，本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量改進(jìn)，采用了尺寸更大、光學(xué)性能更好的不規(guī)則四邊形玻璃棱鏡，光學(xué)檢測精度和系統(tǒng)集成方面也有了很大提高。同時(shí)，系統(tǒng)集成了用于生物樣本溶液流動(dòng)的流路結(jié)構(gòu)和光學(xué)信號(hào)采集及分析模塊，實(shí)現(xiàn)了一個(gè)完整的小型化SPR生物傳感檢測裝置原型。

1 傳感器設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

1．1 基本原理

SPR是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)入射光以大于臨界角入射到2種不同折射率的介質(zhì)界面（如玻璃與其表面的金）時(shí)，可引起金屬中自由電子的共振。自由電子吸收了入射光的能量，從而使反射光有一定程度的衰減，其程度與入射角度相關(guān)。使反射光下降到最小的入射角稱為SPR角，它的大小依賴于緊靠在金屬薄膜一側(cè)的表面介質(zhì)的折射率。由此可以通過檢測SPR角來判定介質(zhì)的變化。

1．2 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

SPR生物傳感器（圖1）主要包括光學(xué)、傳感反應(yīng)、檢測、流通、數(shù)據(jù)采集等模塊以及計(jì)算機(jī)，能夠?qū)崿F(xiàn)SPR檢測、待測物的進(jìn)出樣以及檢測信號(hào)的采集、顯示與分析等。檢測時(shí)，紅光二極管發(fā)出一束發(fā)散光入射到一側(cè)鍍有金膜的傳感芯片。由于入射光為同一點(diǎn)光源產(chǎn)生的發(fā)散光，包含了一定的入射角范圍。當(dāng)滿足共振條件時(shí)，某一角度入射光會(huì)在敏感芯片上發(fā)生SPR共振。光束通過反光鏡反射到線陣CCD上，線陣CCD［5］上不同的像素點(diǎn)對應(yīng)著不同的入射角，當(dāng)檢測到某一區(qū)域像素點(diǎn)的光強(qiáng)明顯減弱時(shí)，其對應(yīng)的角度就是SPR共振角。

圖1 小型化SPR傳感裝置Fig 1 Miniaturized SPR sensing device

1．3 光學(xué)系統(tǒng)

SPR共振角大小與待測樣品種類、濃度密切相關(guān)。入射光角度變化范圍和可檢測反射光范圍越大，能夠檢測的共振角范圍和樣品種類越多、濃度變化范圍也越大。為了使可檢測的入射光角度盡量大，對光源（LED）的位置、傳感界面的尺寸（圖2中b面）和傳感界面與光源所在表面的夾角（圖2（a）中θ）進(jìn)行了優(yōu)化。

圖2 棱鏡結(jié)構(gòu)Fig 2 Prism structure

棱鏡外形為六面體（圖2），光路所在截面為一個(gè)不規(guī)則四邊形。優(yōu)化后，四邊形abcd邊長分別為6，4，4．6 cm和1．1 cm，棱鏡與光路界面垂直方向的厚度為2cm。棱鏡b面貼有傳感芯片和流通池;c面為反射面，能夠?qū)⒐夥瓷涞骄€陣CCD上。為了增加入射光的檢測范圍，在尺寸允許的情況下，使b面的尺寸盡可能大。b面與a面的夾角θ為60°，在θ角不是太大（照射在b面上的入射光角度范圍大）的同時(shí)，兼顧了2次反射過程中的光路設(shè)計(jì)。a面下方左側(cè)裝有LED，右側(cè)裝有線陣CCD，實(shí)現(xiàn)光的發(fā)射和接收。LED的位置對入射光檢測范圍的影響比前2個(gè)因素稍小，需要考慮的是LED和CCD能保持在光路中的確定位置，并具有一定的間距，盡量減少棱鏡中不同部位的反射光對檢測結(jié)果的干擾。LED距離a面左端7 mm，線陣CCD中心點(diǎn)距離a面右端27 mm。與TI Spreeta傳感器的棱鏡（1．6 cm×0．9 cm ×1．2 cm ×0．7 cm）相比，本裝置棱鏡尺寸較大，可以增加入射角度范圍（從Spreeta傳感器的4°增加到13°），可檢測樣本種類和濃度變化范圍大大增加。同時(shí)，玻璃比TI Spreeta傳感器中的塑料透光性更好，光學(xué)性質(zhì)受溫度影響也更小，其折射率隨溫度變化率（10－6K－1）僅為光學(xué)塑料的1/60［6］，因此，可檢測樣品的折射率范圍和穩(wěn)定性更高。

TI Spreeta傳感器光源采用波長為830 nm的近紅外光LED。已有研究［7］表明，在入射光波段為630～670 nm時(shí)，SPR共振峰最尖銳，曲線效果最好，所以，本裝置采用波長為670 nm的紅光LED。TI Spreeta的光電檢測器采用像素點(diǎn)為128的線陣硅光二極管，角度分辨率在0．1°數(shù)量級(jí)，而本裝置采用的線陣CCD像素點(diǎn)為5000（TCD1501D，日本東芝），角度分辨率在0．01°數(shù)量級(jí)，檢測精度有顯著提高。同時(shí)，高像素點(diǎn)線陣CCD比機(jī)械掃描裝置體積更小。由于不同角度的入射光通過2次反射到達(dá)CCD檢測面的路徑有所差異，入射角與CCD檢測點(diǎn)的距離變化并不是線性相關(guān)的，需要做一些修正:從0像素點(diǎn)開始，每隔100像素點(diǎn)分別計(jì)算其對應(yīng)的入射角度值，直至5 000像素點(diǎn)，然后對這50個(gè)入射角度值進(jìn)行擬合，利用擬合來保證了像素點(diǎn)與入射角度之間對應(yīng)關(guān)系。

光路中除了光源、棱鏡、檢測器，還包括敏感界面和反光鏡這2個(gè)反光表面。TI Spreeta直接將金膜鍍在棱鏡表面作為敏感面，金膜使用次數(shù)非常有限，如果金膜損壞，必須更換棱鏡。由于光學(xué)性能好的棱鏡制作昂貴，這也限制了其廣泛應(yīng)用。本文中，敏感芯片［8］采用一側(cè)鍍有金膜的蓋玻片，通過匹配油粘貼在棱鏡表面。敏感芯片成本低，在損壞后可以直接拋棄。棱鏡頂面安置的反光鏡可以反射入射光束，使光源和光檢測器位于同一平面內(nèi)，簡化了裝置結(jié)構(gòu)，也減小了體積。反光鏡的反射率高達(dá)90%，能夠有效減少光能量的損耗。

1．4 流通模塊

SPR生物傳感分析的待檢測樣品大多是溶液，需要在系統(tǒng)中集成流通模塊來實(shí)現(xiàn)樣品的流入、分析和流出。一個(gè)完整的流通模塊主要由樣品池、通道和流體驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)組成（圖3）。為了保證樣品溶液連續(xù)穩(wěn)定流動(dòng)，采用TJP—3A/W0109—1B注射泵（中國格蘭）進(jìn)行液體輸送。注射泵一次注射的容量范圍為 5 μL～60 mL，線性速度范圍為7．94 μm/min～ 79．4 mm/min，可完成灌注、抽取、先灌注后抽取和先抽取后灌注4種傳輸模式，并能夠?qū)崿F(xiàn)樣品溶液的微量恒流。

為了達(dá)到較高的檢測精度，足夠大的敏感界面也同樣重要。檢測系統(tǒng)采用了5 mm×12 mm的敏感界面。六邊形流通池用聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane，PDMS）加工制成，能夠提高液體流動(dòng)的穩(wěn)定性與均勻性［9］。流通池中間區(qū)域的面積與敏感界面相當(dāng)，深度為2 mm，兩端接上細(xì)軟管，一端為進(jìn)樣端，另一端為出樣端。

圖3 流體驅(qū)動(dòng)模塊Fig 3 Fluid driving module

1．5 數(shù)據(jù)采集模塊

數(shù)據(jù)采集模塊核心芯片為FX2CY7C68013（CYPRESS公司），該芯片集USB 2．0收發(fā)器、串行接口引擎、增強(qiáng)的8051內(nèi)核、I2C總線接口和通用可編程GPIF于一體，大大提高了數(shù)據(jù)傳輸速率。它讀入線陣CCD檢測到的光強(qiáng)，進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換，然后通過USB總線輸出。行同步脈沖的上升沿對應(yīng)于CCD有效像元輸出的開始，像元同步脈沖的上升沿則對應(yīng)于每個(gè)像元輸出的有效部分。行同步脈沖周期則是積分時(shí)間，積分時(shí)間和驅(qū)動(dòng)頻率的設(shè)置由接口軟件給出，其采樣頻率最高可達(dá)20 MHz。

軟件采用微軟公司的Visual C++6．0開發(fā)，主要功能是對數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)置，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行存儲(chǔ)和顯示。

2 實(shí)驗(yàn)分析

為了測試新研制的SPR傳感檢測系統(tǒng)的線性度和穩(wěn)定性，利用水、空氣及不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行了共振檢測分析。

2．1 線性度分析

SPR檢測系統(tǒng)的線性度可以通過檢測已知折射率溶液的共振角得出。配制體積分?jǐn)?shù)為2%～20%的乙醇溶液，以2%遞增。對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行10次檢測，得到共振角與折射率的關(guān)系曲線（圖4）。結(jié)果表明:隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，折射率逐漸增大，其共振角也逐漸增大。

圖4 折射率—共振角擬合直線Fig 4 Fitting straight line of refractive index vs resonance angle

通過最小二乘法得到擬合直線方程為:y=135．6x－116．6，相關(guān)系數(shù)R=0．996 5，表明該SPR檢測儀器具有很高的檢測線性度。

2．2 穩(wěn)定性分析

穩(wěn)定性是衡量SPR檢測儀器的另一個(gè)重要指標(biāo)，它可以通過重復(fù)測量得到的共振角標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來判定。若標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值較小，則穩(wěn)定性較好;反之，亦然。

在相同條件下，分別對空氣和水進(jìn)行10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1。

表1 空氣、水共振角及均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 1 Resonance angle，standard deviation，relative standard deviation of air and water

結(jié)果表明:空氣的SPR共振角為51．993°，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．157°，相 對 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 為 0．30%;水 的 SPR 共 振 角 為64．042°，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．133°，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0．21%?？諝夂退南鄬?biāo)準(zhǔn)偏差均小于0．5%，因此，本系統(tǒng)具有很好穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文在TI Spreeta傳感器的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了光路結(jié)構(gòu)并集成了流路和檢測系統(tǒng)，形成了一個(gè)完整的SPR傳感檢測設(shè)備。在光路結(jié)構(gòu)中，改進(jìn)了棱鏡的外形尺寸和材料，增大了光源入射角度范圍，可以進(jìn)行更多樣品的SPR檢測。同時(shí)，采用波長630 nm的紅光LED，增加了SPR峰的深度，能夠更加準(zhǔn)確地確定SPR共振角的位置，提高了檢測精度和靈敏度。采用高像素點(diǎn)線陣CCD，也有助于獲得更高的檢測精度。傳感芯片采用一側(cè)鍍有金膜的蓋玻片，大大降低了成本，可以重復(fù)使用。在新建立的SPR實(shí)驗(yàn)裝置上利用空氣、水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行了多次傳感檢測分析。實(shí)驗(yàn)研究表明:該裝置不僅能夠?qū)我粯颖具M(jìn)行精確檢測，而且重復(fù)性、線性度和穩(wěn)定性都很好。

［1］ Shagufta H K，Kriszta F，Raj K，et al．A versatile method to measure the binding to basic proteins by surface plasmon resonance［J］．Analytical Biochemistry，2012，421（2）:385 －390．

［2］ Li Y，Liu X，Lin Z．Rencent developments and applications of surface plasmon resonance biosensors for the detection of mycotoxins in foodstuffs［J］．Food Chemistry，2012，132（3）:1549 － 1554．

［3］ Ou H C，Luo Z F，Jiang H，et al．Indirect inhibitive immunoassay for estradiol using surface plasmon resonance coupled to online intube SPME［J］．Analytical Letters，2009，42（17）:2758 － 2773．

［4］ Chinowsky T M，Guinn J G，Bartholomew D U，et al．Performance of the Spreeta 2000 integrated surface plasmon rensonance affinity sensor［J］．Sensors and Actuators B，2003，91（1 － 3）:266 －274．

［5］ 王慶友．光電傳感器應(yīng)用技術(shù)［M］．北京:機(jī)械工業(yè)出版社，2009:155－178．

［6］ Moreira C S，Lima A M N，Neff H，et al．Temperature-dependent sensitivity of surface plasmon resonance sensors at the gold-water interface［J］．Sensors and Actuators B，2008，134（2）:854 －862．

［7］ 曾 捷，梁大開，杜 艷，等．基于反射光強(qiáng)度檢測的棱鏡SPR 傳感器［J］．光電子·激光，2007，18（2）:159 －163．

［8］ 楊 軍，王 敏，李圓怡，等．一種高精度SPR生物傳感器的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)［J］．傳感器與微系統(tǒng)，2010，29（7）:96 －98．

［9］ 丁麗麗，鄧 炎，陳 穎，等．用于SPR陣列檢測的微流體池流場分布［J］．清華大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，51（4）:439－442．