王 誠，張超群，吳海龍，黃身鐮，曹敏杰

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建廈門361021;2.福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361021)

0 引言

魚類死后肌肉的尸僵和軟化過程影響著魚肉的品質(zhì).排除微生物等外源因素的影響，由內(nèi)源性酶類作用而引起的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)降解被認(rèn)為是導(dǎo)致魚肉變軟的主要原因［1］.以往的研究認(rèn)為，組織蛋白酶分解肌原纖維蛋白并導(dǎo)致魚肉變軟［2］.但是，魚肉中最初的中性pH值環(huán)境并不適合組織蛋白酶表現(xiàn)活性，而且組織蛋白酶作為存在于溶酶體的酶，表現(xiàn)其降解活性時(shí)需要從溶酶體中被釋放出來.Kubota等人［3］利用對(duì)活魚靜脈注射不同種類蛋白酶抑制劑的方法，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠顯著抑制魚肉的軟化.因此，推測(cè)魚體死后的肌肉軟化這一系列復(fù)雜的過程與內(nèi)源性金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的作用有關(guān).

膠原蛋白是魚肌肉結(jié)締組織及細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，膠原蛋白的降解與魚肉的彈性密切相關(guān)［4］.最新的研究認(rèn)為，膠原蛋白酶是導(dǎo)致魚肉變軟的重要原因.迄今為止，在魚肉中發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白酶主要有金屬蛋白酶和溶膠原的絲氨酸蛋白酶2類.能分解膠原蛋白酶的金屬蛋白酶已在太平洋斑鰭鲉 (Sebastes sp)［5］、大西洋鮭魚 (Salmo salar)［6］和香魚 (Plecoglossus altivelis)［7］中被發(fā)現(xiàn). 溶膠原的絲氨酸蛋白酶則在沙丁魚(Sardinella aurita)［8］和赤 (Dasyatis akajei)［9］中被報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)室先后從海水真鯛魚(Pagrus major)肌肉中發(fā)現(xiàn)了能在4℃下降解膠原蛋白的金屬蛋白酶［10］，在藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)肌肉中發(fā)現(xiàn)了溶膠原的絲氨酸蛋白酶［11］.本文以淡水鯉魚(Cyprinus carpio)為研究對(duì)象，對(duì)淡水魚肌肉中能引起膠原蛋白降解的膠原蛋白酶進(jìn)行研究，以期為今后研究膠原蛋白酶在魚體中的生理功能提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活鯉魚 (質(zhì)量約2 kg)購于廈門市集美市場(chǎng)，即殺后取肌肉.DEAE-Sephacel和Phenyl-Sepharose購自美國GE Healthcare公司;牛明膠、Benzamidine、Aprotinin、1，10-phenanthroline monohydrate購自美國Sigma公司;E-64購自美國 Amresco公司;Leupeptin、Pefabloc SC購自德國Roche公司;蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量購于立陶宛Ferment公司和美國Bio-Rad公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;鯉魚Ⅰ型膠原蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備.

Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司;PT-2100組織搗碎機(jī)，瑞士Kinematica公司;Lamda 35紫外分光光度計(jì)，美國Perkin Elmer公司;Biologic LP蛋白質(zhì)柱層析系統(tǒng)，電泳槽及電轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad公司;G:BOX凝膠成像儀，英國Syngene公司;WB-14恒溫水浴，德國Memmert公司;低溫恒溫水浴，日本Eyela公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定及SDS-PAGE

本文均采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定280 nm下吸收值的方法確定蛋白質(zhì)含量.SDS-PAGE凝膠電泳參考Laemmli的方法［12］.電泳完成后，參考Mortz的方法［13］，對(duì)凝膠進(jìn)行銀染色，檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度.

1.2.2 明膠酶譜法測(cè)定蛋白酶活性

酶活力測(cè)定參考Kleiner等［14］的明膠酶譜法，明膠的制備參照SDS-PAGE膠的制備，只是分離膠中用0.5 mL 8 g/L的明膠溶液替換0.5 mL蒸餾水，其余與SDS-PAGE膠的制備相同.具體原理如下:先將酶在不變性的條件下進(jìn)行SDS-PAGE.電泳結(jié)束后將膠取出，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%Triton X-100充分洗去SDS使酶復(fù)性，最后將復(fù)性后的酶與凝膠中的明膠蛋白在合適的條件下反應(yīng).因?yàn)槟z中含有底物明膠蛋白，酶會(huì)將其所處區(qū)域的明膠蛋白分解，所以凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，存在酶的地方不能被染色，而其他區(qū)域被染色.因此，凝膠上有酶存在的區(qū)域呈現(xiàn)負(fù)染色狀態(tài)，表現(xiàn)為亮條帶.

1.2.3 膠原蛋白酶的分離純化

所有純化步驟在4℃下進(jìn)行.500 g鯉魚肌肉切碎后混入4倍體積的緩沖液A(50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0)中，用組織搗碎機(jī)充分搗碎，4℃下8073 r/min離心15 min，取上清液得到粗酶.粗酶經(jīng)30%～60%(體積分?jǐn)?shù))硫酸銨鹽析，將鹽析后的沉淀用最少體積的緩沖液A復(fù)溶，再在相同外液中充分透析除鹽.

將透析好的酶液上樣于預(yù)先用緩沖液A平衡好的DEAE-Sephacel陰離子交換層析柱，以緩沖液A充分流洗去除雜蛋白質(zhì).再用0～0.5 mol/L NaCl作線性洗脫，洗脫總體積為600 mL.用明膠酶譜檢測(cè)活性并收集活性較高部分.將收集的樣品加 (NH4)2SO4至終濃度為1 mol/L，上樣于用含有1 mol/L(NH4)2SO4的緩沖液A平衡好的Phenyl-Sepharose疏水性層析柱.上樣結(jié)束后，先用含1 mol/L(NH4)2SO4的緩沖液A進(jìn)行流洗，然后用0～1 mol/L(NH4)2SO4做線性洗脫，洗脫體積為300 mL.

收集Phenyl-Sepharose疏水性層析柱未吸附部分酶活較高的樣品，加 (NH4)2SO4至終濃度為1.5 mol/L，然后上樣至用含有1.5 mol/L(NH4)2SO4的緩沖液A平衡好的Phenyl-Sepharose疏水性層析柱.上樣結(jié)束后，先用含1.5 mol/L(NH4)2SO4的緩沖液A進(jìn)行流洗，然后用1～1.5 mol/L(NH4)2SO4做線性洗脫，洗脫體積為400 mL.測(cè)定A280，并用明膠酶譜檢測(cè)酶活性，然后用SDSPAGE檢測(cè)酶的純度.

1.2.4 酶的性質(zhì)分析

1)最適溫度 利用明膠酶譜，在20～60℃孵育，測(cè)定酶的最適作用溫度，通過觀察亮帶強(qiáng)弱來確定酶的最適作用溫度.

2)最適pH值 最適pH值的測(cè)定方法為在不同pH值緩沖液中進(jìn)行酶譜孵育，而其他測(cè)定條件不變.其中，不同pH值的緩沖液分別為乙酸鈉 (pH=4.0～5.0)、磷酸鈉 (pH=6.0～7.0)、Tris-HCl(pH=8.0～9.0)和Na2CO3-NaHCO3(pH=10.0～11.0).

3)不同抑制劑對(duì)酶活性的影響 制作明膠酶譜時(shí)，在孵育液中添加不同的蛋白酶抑制劑，以檢測(cè)各種抑制劑對(duì)酶活性的影響.各種抑制劑分別為EDTA、EGTA、1，10-phenanthroline、Pefabloc SC、Benzamidine、E-64、Leupeptin、Aprotinin.

4)不同二價(jià)金屬離子對(duì)酶活性的影響 制作明膠酶譜時(shí)，在孵育液中添加不同的二價(jià)金屬離子，以檢測(cè)各種金屬離子對(duì)酶活性的影響.

5)酶對(duì)I型膠原蛋白的分解作用 將純化得到的酶與鯉魚I型膠原蛋白在30℃下反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為0，0.5，1，2，3，5和8 h.反應(yīng)結(jié)束后，立即將樣品與SDS上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，檢測(cè)CSP對(duì)I型膠原蛋白的降解情況.對(duì)照組為在不加酶時(shí)，膠原蛋白降解8 h后的樣品.

2 結(jié)果

2.1 粗酶中膠原蛋白酶的活性

利用明膠酶譜檢測(cè)粗酶中膠原蛋白酶的活性，其結(jié)果如圖1所示.由圖1可見，在66.2 ku標(biāo)準(zhǔn)蛋白附近檢測(cè)到兩個(gè)主要的活性亮帶.當(dāng)金屬蛋白酶抑制劑EDTA存在時(shí)，分子質(zhì)量較小的活性亮帶被完全抑制.當(dāng)絲氨酸蛋白酶抑制劑Leupeptin和Pefabloc SC存在時(shí)，分子質(zhì)量較高的活性亮帶被顯著抑制.因此可知，在鯉魚肌肉中至少存在分別能被金屬蛋白酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑所抑制的兩種膠原蛋白酶.

Fig.1 Gelatin zymography analysis of the collagenolytic activity in common carp muscle

2.2 膠原蛋白酶的分離純化

硫酸銨鹽析后的樣品經(jīng)DEAE-Sephacel陰離子交換層析后的結(jié)果見圖2.由圖2可知，有3個(gè)主要的亮帶在0.1～0.2 mol/L NaCl時(shí)被洗脫下來.收集活性較高的組分，經(jīng)Phenyl-Sepharose疏水層析柱繼續(xù)純化.由圖3a可知，Phenyl-Sepharose疏水柱層析中，目的蛋白酶CSP的亮帶在未吸附部分被發(fā)現(xiàn)，此過程中Phenyl-Sepharose疏水層析柱吸附了大量的雜蛋白質(zhì).將Phenyl-Sepharose疏水層析柱未吸附部分收集到的CSP加 (NH4)2SO4至終濃度為1.5 mol/L，使其能被Phenyl-Sepharose疏水層析柱吸附.由圖3b可知，CSP在 (NH4)2SO4為1.3～1.4 mol/L時(shí)被洗脫下來.通過SDS-PAGE對(duì)CSP進(jìn)行分析 (見圖4)，CSP得到了高度純化，其分子質(zhì)量約為70 ku.

圖2 DEAE-Sephacel離子交換層析Fig.2 DEAE-Sephacel chromatography

圖3 CSP的二次Phenyl-Sepharose純化柱層析圖Fig.3 The two Phenyl-Sepharose chromatographic purification of CSP

2.3 膠原蛋白酶的性質(zhì)分析

2.3.1 酶的最適溫度

通過明膠酶譜，在不同溫度下孵育的方法，檢測(cè)酶的最適作用溫度，其結(jié)果見圖5.由圖5可知，在30～40℃時(shí)，CSP顯示較強(qiáng)的活性，而在30℃時(shí)活性最高，在50℃下CSP仍能顯示出顯著的活性.

2.3.2 酶的最適pH值

分別在酶的最適溫度下，改變制備明膠酶譜時(shí)孵育液的pH值，檢測(cè)在不同pH值條件下膠原蛋白酶分解明膠的能力，其結(jié)果如圖6所示.由圖6可知，CSP在pH=6～9時(shí)都能表現(xiàn)出活性，在pH=8～9時(shí)表現(xiàn)的活性較高，說明該酶屬于弱堿性蛋白酶.

2.3.3 不同抑制劑對(duì)酶活力的影響

由圖7可見，絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc SC、Leupeptin和Benzamindine均能顯著抑制CSP的活性.但是，1，10-phenanthroline monohydrate、EDTA和EGTA等金屬蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑Aprotinin及E-64對(duì)CSP的活性影響不明顯.可見，CSP是一種可以分解膠原蛋白的絲氨酸蛋白酶.

圖4 純化的CSP的SDS-PAGE及明膠酶譜圖Fig.4 SDS-PAGE and gelatin zymography of purified CSP

圖5 CSP最適溫度的明膠酶譜分析Fig.5 Gelatin zymography analysis of the optimum temperature of CSP

圖6 不同pH值條件對(duì)酶活性的影響Fig.6 Gelatin zymography analysis of the effect of pH on CSP

圖7 不同蛋白酶抑制劑對(duì)CSP活性的抑制作用Fig.7 Effect of different proteinase inhibitors on CSP

2.3.4 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響

如圖8所示，在酶譜孵育液中加入Co2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+，CSP的活性被抑制，而加入Ba2+、Ca2+和Zn2+時(shí)，CPS的活性沒有受到影響.

2.3.5 膠原蛋白酶對(duì)I型膠原蛋白的降解作用

如圖9所示，CSP能顯著降解鯉魚肌肉I型膠原蛋白.反應(yīng)1 h就能看到膠原蛋白被明顯降解.反應(yīng)2 h時(shí)，膠原蛋白的β鏈已基本被CSP降解完全，5 h時(shí)，膠原蛋白的α鏈完全被降解.比較β鏈和α鏈的降解情況可以發(fā)現(xiàn)，β鏈比α鏈更容易被CSP降解.

圖8 不同二價(jià)金屬離子對(duì)CSP活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of CSP

圖9 CSP對(duì)鯉魚Ⅰ型膠原蛋白的分解作用Fig.9 Degradation of common carp typeⅠcollagen by CSP

3 討論

近期的研究表明，魚肉中膠原蛋白在冷藏期間發(fā)生降解是引起魚肉變軟的重要原因［4］.本實(shí)驗(yàn)利用明膠酶譜法，在鯉魚肉中檢測(cè)到了能夠降解膠原蛋白的絲氨酸蛋白酶，并通過硫酸銨鹽析及一系列柱層析法對(duì)絲氨酸蛋白酶進(jìn)行了純化，純化的絲氨酸蛋白酶 (CSP)分子質(zhì)量約為70 ku.性質(zhì)分析結(jié)果表明，CSP在堿性條件下顯示活性，最適反應(yīng)溫度為30℃.Ca2+、Ba2+和Zn2+對(duì)CSP的活性沒有影響，而Co2+、Mn2+、Cu2+和Mg2+對(duì)CSP的活性有抑制作用.CSP的活性被絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制而不受其他類型抑制劑的影響，由此可以判斷，CSP是一種絲氨酸蛋白酶.

雖然在分子質(zhì)量上存在著差異，但本研究獲得的CSP與沙丁魚(Sardinella aurita)［8］和赤(Dasyatis akajei)［9］中可以分解膠原蛋白的絲氨酸蛋白酶 (分子質(zhì)量分別為14.2 ku和97 ku)在性質(zhì)上較為接近.與本研究室從藍(lán)圓鲹(Decapterus maruadsi)［11］肌肉中純化得到的能分解膠原蛋白的絲氨酸蛋白酶相比，雖然在最適溫度和最適pH值等性質(zhì)上表現(xiàn)出一致性，但從藍(lán)圓鲹中得到的絲氨酸蛋白酶的分子質(zhì)量為60 ku，比CSP的分子質(zhì)量70 ku略低.另外，CSP在50℃條件下仍能在明膠酶譜上檢測(cè)出較明顯的活性，說明CSP是一種熱穩(wěn)定性較好的絲氨酸蛋白酶.

在前期研究中，伍久林等［15］從鯉魚紅色肉中純化得到了具有降解膠原蛋白能力的金屬蛋白酶(分子質(zhì)量為75 ku).本研究獲得的CSP與鯉魚紅肉金屬蛋白酶在分子質(zhì)量上接近，且都能降解I型膠原蛋白，但它們?cè)诿笇W(xué)性質(zhì)上存在顯著差異，表明鯉魚肌肉中存在多種不同的可降解膠原的蛋白酶.絲氨酸蛋白酶與金屬蛋白酶均有較強(qiáng)膠原蛋白降解活性，共同參與魚體死后肌肉的軟化過程.

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