吳海龍，陳雪芳，王 誠，蔡秋鳳，曹敏杰

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

0 引言

胰蛋白酶抑制劑 (Trypsin Inhibitor，TI)廣泛分布于動物、植物和微生物中，是對胰蛋白酶和類胰蛋白酶具有特異性抑制作用的一類物質(zhì)，它能調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動［1-3］.迄今為止，很多豆科類植物和哺乳動物胰腺中的胰蛋白酶抑制劑的生理功能、抑制機理及其結構都得到了深入研究.來源于哺乳動物胰腺的抑肽酶在臨床上也被廣泛用于胰腺炎治療、休克和手術止血等方面，特別是通過抑制激肽釋放酶以及纖溶酶而達到止血的目的，能顯著減輕手術中及手術后病人出血狀況［4-5］.我國水域遼闊，水生生物種類繁多，由于其生活環(huán)境的特殊性，其所含的胰蛋白酶抑制劑與陸生生物具有不同的特性，近年來已逐步成為關注的熱點.Nagle等［6］發(fā)現(xiàn)在腹足綱動物椎實螺(Lymnaea)的卵黃中存在一種由57個氨基酸殘基組成的胰蛋白酶抑制劑;Kishimura等［7-9］從太平洋魷魚(Todarodes pacificus)的肝臟中分離得到一種對酸、熱穩(wěn)定，分子質(zhì)量約為6300 u的TI，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)對患有糖尿病小鼠具有降血糖作用，并進一步分析了其降血糖的機理;Xue等［10-11］從牡蠣(Crassostrea virginica)血漿中純化得到分子質(zhì)量為7609.6 u的TI，并研究其氨基酸組成及抑制作用的特點等，并發(fā)現(xiàn)該抑制劑可能參與牡蠣的免疫調(diào)節(jié).章魚(Octopus fangsiao)作為一種典型的海洋生物，屬于軟體動物門頭足綱，在地中海地區(qū)以及東方國家長期以來被視為一種佳肴.2010年，我國章魚年捕撈量達13萬t［12］.章魚加工過程中產(chǎn)生的內(nèi)臟一般用于制作魚粉或直接丟棄，造成了資源浪費和環(huán)境污染.本文旨從章魚內(nèi)臟中分離純化胰蛋白酶抑制劑 (Octopus Trypsin Inhibitor，OTI)，并研究其生化性質(zhì)以及抑制作用的特點，以期探索其生理學功能，同時也為海洋軟體動物胰蛋白酶抑制劑的研究提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

章魚內(nèi)臟由廈門市東海洋水產(chǎn)品進出口有限公司提供 (新鮮章魚即殺后取內(nèi)臟凍存于-80℃待用);新鮮藍圓鲹(Decapterus marusdsi)購自廈門市集美菜市場;SP-Sepharose Fast Flow購自美國GE Healthcare公司;SDS-PAGE用標準蛋白、牛血清白蛋白和牛血紅蛋白購自美國Bio-Rad公司;豬胰蛋白酶、豬胰凝乳蛋白酶、豬胃蛋白酶和木瓜蛋白酶為美國Sigma公司產(chǎn)品;熒光底物 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA和Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA為日本Peptide Institute公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

Avanti JA-25高速冷凍離心機 (Beckman，美國);Lamda 35型紫外分光光度計 (Perkin Elmer，美國);FP-6200熒光分光光度計(Jasco，日本);G:Box凝膠成像儀 (Syngene，英國);組織搗碎機 (Kinematica，瑞士);WB-14恒溫水浴鍋 (Memmert，德國);蛋白質(zhì)電泳裝置 (Bio-Rad，美國);膜超濾裝置(Millipore，美國).

1.2 實驗方法

1.2.1 OTI的分離純化

取章魚內(nèi)臟，加入3倍體積的蒸餾水，用組織搗碎機搗碎均質(zhì).將勻漿液在4℃ 下8073 r/min離心20 min，絹布過濾取上清液.上清液在80℃下水浴加熱20 min后立即用冰水冷卻，在4℃下8073 r/min離心20 min，取上清液，并將樣品pH值調(diào)至5.0，靜置半小時后在4℃下8073 r/min離心20 min，收集上清液作為粗樣.粗樣經(jīng)40%～90%硫酸銨 (體積分數(shù))鹽析后，沉淀用少量的20 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH=4.5)(緩沖液A)中復溶，然后將所得樣液用Pellicon XL膜(10 ku)超濾，收集濾出液.濾液用緩沖液A充分透析后，上樣于事先用緩沖液A平衡的SP-Sepharose陽離子交換層析柱 (2.5 cm×16 cm)，用緩沖液A充分流洗去除未吸附蛋白質(zhì)，吸附部分蛋白質(zhì)用含0.1 mol/L NaCl的緩沖液A充分流洗，再用含0.1～0.5 mol/L NaCl的緩沖液A進行線性洗脫，收集活性峰，檢測蛋白質(zhì)純度及酶抑制活力.

1.2.2 OTI活力的測定

以Boc-Phe-Ser-Arg為熒光底物，在850 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，分別加入50 μL適量的商品胰蛋白酶和抑制劑，37℃孵育10 min后，再加入50 μL熒光底物37℃孵育10 min，立即加入1.5 mL終止液 (V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(水)=35∶30∶35)終止反應，用熒光分光光度計在激發(fā)波長為380 nm和發(fā)射波長為450 nm下測定反應釋放出的7-氨基-4-甲基香豆素 (7-amino-4-methycoumarin，AMC)的含量.對照組用相同的緩沖液A代替抑制劑.一個酶活力單位定義為每分鐘分解Boc-Phe-Arg-MCA熒光底物釋放出0.1 nmol AMC所需的酶量，一個單位的胰蛋白酶抑制劑的抑制活性表示抑制一個單位胰蛋白酶的抑制劑量.

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度測定

純化過程，用280 nm波長下的吸光度值作為蛋白質(zhì)含量，其余蛋白質(zhì)濃度采用Lowry法［13］測定，以牛血清白蛋白為標準蛋白.

1.2.4 SDS-PAGE及Tricine-SDS-PAGE

SDS-PAGE參照Laemmli法［14］進行，以考馬斯亮藍染色;Tricine-SDS-PAGE依照Schagger法［15］基于甘氨酸-Tris和Tricine-Tris體系電泳，然后進行銀染色.

1.2.5 熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性測定是將胰蛋白酶抑制劑加入50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，在不同溫度(40、50、60、70、80、90、100℃)下分別加熱1 h、2 h后，按照測抑制活性的方法測定剩余的抑制活性，不加熱的OTI作為對照.

pH值穩(wěn)定性測定是將胰蛋白酶抑制劑室溫下在不同pH值 (1.0～11.0)緩沖液中放置30 min后，按照測抑制活性的方法測定剩余的抑制活性.

1.2.6 抑制特異性分析

為測定OTI的抑制特點，測定其對不同蛋白酶的抑制特異性.將不同終質(zhì)量濃度梯度 (0，0.5，1 μg/mL)的OTI分別加入50 μL適量濃度的豬胰蛋白酶、豬胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等反應體系中，按照測抑制活性的方法測定抑制劑對不同蛋白酶的抑制活性.測定胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性所用緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，木瓜蛋白酶所用緩沖液為50 mmol/L NaAC-HAC(pH=5.5)，胃蛋白酶所用緩沖液為50 mmol/L NaAC-HCl(pH=3.0).

胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶分別以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA和Z-Phe-Arg-MCA為熒光底物，按照上述方法測定酶活力.胃蛋白酶的活力依照Anson的方法［16］以酸變性牛血紅蛋白為底物進行測定.

1.2.7 OTI對肌原纖維蛋白分解的抑制作用

1.2.7.1 肌原纖維蛋白的制備

新鮮藍圓鲹肌肉 (質(zhì)量約20 g)于4倍體積冰冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，用組織搗碎機搗碎，將懸浮液在4℃下6724 r/min離心15 min，取沉淀.將沉淀重新懸浮于4倍體積的50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中并搗碎，以同樣的條件離心，取沉淀，如此重復4次.將最后一次離心得到的沉淀溶解在含有0.5 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，即為藍圓鲹肌原纖維蛋白.

1.2.7.2 OTI對肌原纖維蛋白降解作用的影響

在50 μL含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，加入50 μL適當濃度的肌原纖維，并加入100 μL OTI使其終質(zhì)量濃度達到1.5 μg/mL，4℃下放置20 min以保證OTI與肌原纖維充分作用，然后置于55℃加熱不同時間 (0，15 min，30 min，45 min，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h).對照組為50 μL肌原纖維溶于150 μL含0.5 mol/L NaCl的20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中.加熱后樣品立即加入100 μL 8 mol/L尿素，混勻后用含質(zhì)量分數(shù)5%的β-巰基乙醇4×SDS進行SDS-PAGE分析，觀察肌原纖維蛋白的降解情況.

2 結果與討論

2.1 OTI的分離純化

章魚內(nèi)臟均質(zhì)后經(jīng)過熱處理、硫酸銨鹽析和超濾后，上樣于事先用緩沖液A平衡的SP-Sepha-rose離子交換層析柱.由圖1可知，SP-Sepharose可以有效地吸附目的蛋白，并能將雜蛋白質(zhì)與目的蛋白分開.目的蛋白OTI約在0.3 mol/L NaCl的鹽濃度下被洗脫下來.對活性部分進行電泳分析，Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜(見圖2)顯示，純化得到分子質(zhì)量約為6500 u的單一蛋白質(zhì)條帶，與太平洋魷魚(T.pacificus)(6300 u)［7］、哺乳動物胰臟Kunitz型抑制劑 (6513 u)［17］和哺乳動物胰臟Kazal型抑制劑 (6155 u)［18］分子質(zhì)量相當，為小分子質(zhì)量胰蛋白酶抑制劑.但與豆類來源的Kunitz型抑制劑 (22000 u)［19］有較大差距，與Bowman-Birk型抑制劑 (8887 u)［20］較接近.所得高純度章魚TI直接用于實驗或凍存于-20℃冰箱備用.

經(jīng)過熱處理、硫酸銨鹽析、超濾、SP-Sepharose陽離子交換層析得到較高純度的OTI，其結果如表1所示.純化倍數(shù)為340.7，抑制比活力為47.7 U/mg，回收率為7.63%.需要指出的是，本文為得到高純度的OTI以準確分析其性質(zhì)，最終回收率僅為7.63%.在食品領域的實際應用中，對OTI的純度要求較低，可以通過簡化其分離過程以提高回收率.

圖1 OTI的SP-Sepharose純化柱層析圖Fig.1 SP-Sepharose chromatographic purification of OTI

圖2 純化的OTI的電泳圖譜Fig.2 Tricine-SDS-PAGE of the purified OTI

表1 OTI的純化表Tab.1 Summary of the purification of OTI

2.2 熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性分析結果如圖3所示，OTI在100℃下加熱1 h后，其抑制活性剩余90%，加熱2 h后，其抑制活性仍有65%.圖4顯示OTI在不同pH值 (1.0～11.0)下放置30 min后，抑制活性基本不變，表明該抑制劑具有良好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性.該結果與其他小分子質(zhì)量蛋白酶抑制劑相似，如太平洋魷魚(T.pacificus)胰蛋白酶抑制劑用2.5%的高氯酸處理后依然很穩(wěn)定，并且在80℃下加熱2 h仍然保留約70%的活性［7］.綠豆胰蛋白酶抑制劑 (Mung Bean Trypsin Inhibitor，MB-TI)在pH=2～11范圍內(nèi)非常穩(wěn)定，而且在100℃ 條件下加熱1 h后還剩余約85%活性［20］.

圖3 OTI的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of purified OTI

圖4 OTI的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of purified OTI

2.3 抑制特異性分析

圖5顯示OTI對不同種類蛋白酶的抑制情況.由圖5可以看出，當OTI的終質(zhì)量濃度達到0.5 μg/mL時，能抑制胰蛋白酶約40%活性，當終質(zhì)量濃度達到1.0 μg/mL時，能夠抑制胰蛋白酶約70%活性，表明OTI對胰蛋白酶有較強抑制作用并呈濃度相關性.然而，對絲氨酸蛋白酶家族的胰凝乳蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶家族的木瓜蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶家族的胃蛋白酶卻沒有明顯抑制活性，表明OTI對胰蛋白酶具有特異性抑制作用.

圖5 OTI對不同蛋白酶的抑制特異性Fig.5 Inhibition specificity of OTI to different proteinases

2.4 OTI對肌原纖維蛋白降解作用的影響

動物肌原纖維由多種結構蛋白質(zhì)組成，主要有肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白等.魚體死亡后，肌肉由于內(nèi)源性蛋白酶的作用而產(chǎn)生降解.如圖6a所示，藍圓鲹肌原纖維蛋白在不添加OTI的情況下，在55℃下加熱60 min后肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain，MHC)已有較大程度的分解，當反應時間延長到120 min時，MHC幾乎完全分解.本實驗室之前的研究結果表明，這主要是由于藍圓鲹肌肉組織中存在一種類似于胰蛋白酶的肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶 (Myofibril-Bound Serine Proteinase，MBSP)，MBSP能夠在55℃下強烈分解MHC，并能在一定程度上引起TM的降解，進而影響肌原纖維蛋白的結構穩(wěn)定［20-21］.在OTI存在下，如圖6b所示，加熱60 min時，MHC的分解得到了有效的抑制，即使加熱150 min，MHC仍有較大部分殘留，表明OTI對由MBSP引起的肌原纖維蛋白降解情況有良好的抑制效果.

魚糜制品的凝膠劣化常常發(fā)生在55～60℃的溫度區(qū)間，不僅影響魚糜制品的彈性，更影響其商品價值.在魚糜生產(chǎn)過程中，魚肉通常會經(jīng)低濃度的堿水漂洗、脫水等工藝，產(chǎn)品中可溶性蛋白酶類(如組織蛋白酶)的殘留量極少，其對肌原纖維蛋白的分解作用影響較?。?2］.MBSP對肌原纖維蛋白，尤其是對MHC的分解作用被認為是引起凝膠劣化現(xiàn)象的主要原因［21］.因此，利用章魚加工下腳料提取一種有效抑制MBSP活性的蛋白酶抑制劑OTI，它能夠抑制由MBSP引起對肌原纖維蛋白的分解，有望提高魚糜制品凝膠彈性，改善其品質(zhì).

圖6 在55℃下不添加和添加OTI下MBSP對藍圓鲹肌原纖維蛋白的降解情況Fig.6 Degradation of blue scad myofibrillar proteins by MBSP in the absence and presence of OTI at 55℃

3 結論

本實驗首次從章魚內(nèi)臟中分離純化得到胰蛋白酶抑制劑OTI，建立了快速有效分離OTI的方法，其分子質(zhì)量約為6500 u，得率為7.63%;純化的胰蛋白酶抑制劑表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性;該抑制劑不僅能夠抑制胰蛋白酶的活性，而且能夠明顯抑制MBSP引起的肌原纖維蛋白的降解.

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