種寶紅，劉保生，李志云，曹世娜

(河北大學 化學與環(huán)境科學學院，河北 保定 071002)

1 引 言

目前，在利用熒光法研究藥物與蛋白相互作用方面，廣泛采用的是以牛血清白蛋白(BSA)為檢測對象的經(jīng)典熒光法［1-2］，主要利用色氨酸殘基(Trp)的熒光變化信息來代表BSA 與藥物之間相互作用的整體信息［3］。然而，BSA 是由近600個氨基酸組成的多肽鏈，其中僅在134 和212 位上有兩個Trp 殘基。一些藥物分子可能會與其他的氨基酸殘基結(jié)合，卻由于所結(jié)合氨基酸殘基的熒光太弱或沒有熒光而無法表現(xiàn)出來，此時經(jīng)典熒光光譜法所表現(xiàn)出來的信息就是不全面、不準確的。而藥物的熒光光譜所反映的信息是藥物整體分子的性質(zhì)。因此，以藥物為檢測對象，考察體系中BSA 對其熒光性質(zhì)的影響，就能獲得二者更準確且更全面的相互作用信息，即本文采用的改進熒光光譜法［4］。

氟洛芬為白色或類白色結(jié)晶性粉末，是動物專用的廣譜抗生素，主要用于豬、牛、魚及禽類的治療［5］。為了解氟洛芬在血漿中游離藥物濃度的變化規(guī)律，研究其與血漿蛋白的結(jié)合，本文用經(jīng)典熒光法、改進熒光光譜法以及紫外光譜法對其與BSA 的相互作用機制進行了研究，并將3 種方法所得結(jié)論進行比較，對氟洛芬與BSA 之間的作用方式進行了更加準確的推測。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

實驗儀器包括:島津制作所的RF-5301PC 熒光光度計及UV-265 紫外光度計，上海雷磁儀器廠pHS-3C 型精密酸度計，南通科學儀器廠CS501型超級恒溫水浴。

牛血清白蛋白(BSA，純度≥99%，Sigma 公司)配成濃度為1.0 ×10－5mol/L 的水溶液;氟洛芬(Fluprofen)標準品(FF，優(yōu)級純，純度≥98%)配成1.0 ×10－3mol/L 的水溶液，用時適當稀釋;含0.15 mol/L NaCl 的pH 為7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液。

2.2 實驗方法

2.2.1 經(jīng)典熒光光譜法

分別在293，303，310 K 下，于一組10 mL 比色管中分別加入1.0 mL 緩沖溶液、0.3 mL 1.0 ×10－5mol/L 的BSA 溶液、不同體積的FF 溶液，用二次石英蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。在激發(fā)波長為280 nm、狹縫均為5 nm 時，記錄340 nm 處的熒光值或熒光光譜。

2.2.2 改進熒光光譜法

在4.0 mL 1.0 ×10－4mol/L 的FF 溶液中加入不同體積的1.0 ×10－5mol/L BSA 溶液，在激發(fā)波長為265 nm 時，掃描發(fā)射光譜，其他同2.2.1。

2.2.3 紫外吸收光譜法

同2.2.2，以相應濃度的BSA 溶液做參比，考察200～350 nm 范圍內(nèi)不同濃度的BSA 對FF 紫外吸收光譜的影響，記錄225 nm 處的吸光度A。

3 結(jié)果與討論

3.1 FF-BSA 體系的經(jīng)典熒光光譜

以BSA 為檢測對象，考察BSA 與FF 之間相互作用的機理，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，隨著FF濃度的增加，BSA 在340 nm 處的熒光強度不斷下降，說明FF 猝滅了BSA 的熒光。按Stern-Volmer方程［6］處理所得數(shù)據(jù):

通過F0/F-［L］圖可得到體系猝滅速率常數(shù)，列于表1。從表1 可知，隨著溫度的升高，Ksv依次減小，由此可推斷該反應過程為靜態(tài)猝滅過程［7］。且FF-BSA 體系在不同溫度下的Kq值均大于2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，進一步說明FF-BSA 體系的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

對于靜態(tài)熒光猝滅過程，采用式(2)［9］計算體系的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點數(shù)n:

圖1 BSA-FF 體系的熒光光譜(T=298 K，λex=280 nm)。Fig.1 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=280 nm).

表1 不同溫度下FF 與BSA 的猝滅反應參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of FF and BSA at different temperatures

其中［L］為猝滅劑的濃度。以lg ［(F0－F)/F］對lg［L］作圖，由曲線的截距和斜率即可求得體系的Ka和n，見表1。由表1 可見，隨著溫度的升高，Ka降低，更加證明FF-BSA 體系的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅過程。

3.2 FF 與BSA 的改進熒光光譜

以FF 為檢測對象，考察藥物與BSA 的相互作用，結(jié)果見圖2。由圖2 可以看到，F(xiàn)F 熒光峰在289 nm 處，隨著BSA 的不斷加入，體系在289 nm處的熒光強度呈加強趨勢。但這并不是由熒光的敏化增強所導致的，而是因為FF 的熒光與BSA的熒光交疊情況嚴重，F(xiàn)F 的熒光與BSA 熒光產(chǎn)生疊加的結(jié)果。因此，本實驗以相應濃度的BSA溶液作空白以排除干擾。處理后的譜圖如圖3 所示，可以看出隨著BSA 濃度的增加，F(xiàn)F 在289 nm處的熒光強度依次猝滅。按照式(1)、(2)計算不同溫度下的猝滅參數(shù)，結(jié)果列于表1。

圖2 FF-BSA 體系的熒光光譜(T=298 K，λex=265 nm)。Fig.2 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=265 nm).

由表1 對比可知，F(xiàn)F-BSA 體系的Ksv及Ka均隨著溫度的升高而降低，體系發(fā)生了靜態(tài)猝滅，說明無論以BSA 還是藥物FF 為檢測對象，得到的蛋白與藥物之間相互作用的機理是一致的。FF 與BSA 的結(jié)合位點數(shù)約為1，而且比傳統(tǒng)熒光法所得到的數(shù)值略大。且相同溫度下，改進法得到的結(jié)合常數(shù)均比經(jīng)典法得到的結(jié)合常數(shù)值大，表明BSA 肽鏈中除了位于212 位上的色氨酸殘基外，其他的殘基也同F(xiàn)F 發(fā)生了相互作用。即FF 與BSA 的作用方式除了FF 與212 位色氨酸殘基間“點對點”的作用方式以外，還有FF 與BSA 疏水區(qū)其他殘基間“點對面”的作用方式［10］。這說明相對于經(jīng)典法以蛋白為檢測對象而言，以藥物為檢測對象能夠更全面且更準確地表達蛋白與藥物的相互作用信息。

圖3 FF-BSA 體系的熒光光譜(扣除BSA)Fig.3 Fluorescence spectra of FF-BSA system (fluorescence of BSA deducted)

3.3 FF-BSA 體系的紫外光譜

蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合常數(shù)Kb與體系的吸光度值存在以下關(guān)系［11］:

其中A0、A 分別為無、有猝滅劑時的吸光度值;［L］為猝滅劑的濃度。以FF 為檢測對象，考察藥物與BSA 的相互作用，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，隨著BSA 濃度的增加，F(xiàn)F 在波長225 nm 處的吸收峰強度有規(guī)律地減弱并發(fā)生紅移，表明BSA 與FF 發(fā)生了相互作用。根據(jù)式(3)，由(A0－A)－1對［L］－1作圖計算體系的Kb，其結(jié)果見表2。由表2 可知Kb隨溫度增加而下降，與熒光法得到的結(jié)論相同，Kb值與改進法Ka接近，證明了改進法的正確性。結(jié)合常數(shù)的差異可能是由熒光法與紫外法方法上的差異所造成的。

圖4 FF-BSA 體系的紫外吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of FF-BSA system (T=293 K)

表2 紫外吸收光譜法測得FF-BSA 體系不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Table 2 The binding constants of FF-BSA system by UV absorption spectrometry at different temperatures

3.4 FF 與BSA 之間的作用力類型

生物大分子與藥物間相互作用的熱力學參數(shù)可以通過下式計算［12］:

溫度變化不大時，可以將反應的焓變ΔH 看作定值［13］，根據(jù)體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K，以RlnK 對T－1作圖，得出FF-BSA 體系的熱力學參數(shù)，結(jié)果見表3。藥物與蛋白之間的結(jié)合能否自發(fā)進行取決于體系的ΔG，而焓變的減少或者熵變的增加，都有利于反應的自發(fā)進行。由表3 可知，利用3 種不同的方法得到該體系的熱力學參數(shù)均為ΔG＜0，ΔS ＞0，ΔH＜0，表明FF 與BSA 反應可以自發(fā)地進行，F(xiàn)F 與BSA 之間的相互作用力主要是靜電引力［14］。比較經(jīng)典法與改進法及紫外法的ΔG 以及ΔS 的數(shù)值，可知以FF 為檢測對象反應更容易進行。改進法和紫外法得到的熱力學參數(shù)很接近，表明利用改進法研究BSA-FF體系的相互作用機理是準確的。

表3 不同溫度下FF-BSA 體系的熱力學參數(shù)Table 3 The thermodynamic parameters of FF-BSA at different temperatures

3.5 藥物協(xié)同性

Hill 系數(shù)nH能夠用來定量分析蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的協(xié)同性［15-16］:

其中，K 為結(jié)合常數(shù)，Y 為結(jié)合飽和分數(shù)。

在熒光實驗中:

在紫外吸收實驗中:

式中，1/Qm為以1/Q 對1/［L］作圖的截距。再根據(jù)式(6)，以lg［Y/(1－Y)］對lg［L］作圖，得出FF-BSA 體系的nH值，結(jié)果列于表4。由表4可知，各溫度下的nH均大于1，表明FF 與BSA結(jié)合過程中，隨著FF 不斷結(jié)合到結(jié)合位點上，后繼配體與BSA 的親和性不斷加強，表現(xiàn)為正協(xié)同效應即正協(xié)同性［17］，但其正協(xié)同性較弱。同時，隨著溫度的升高，體系的nH降低，說明溫度升高時后繼配體與BSA 的親和性降低，這與前面得到的“BSA-FF 體系的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而降低”結(jié)論相一致。3 種方法所得nH值接近，也證明了改進法的正確性。

表4 不同溫度下FF-BSA 體系的Hill 系數(shù)Table 4 Hill coefficient of FF-BSA systems at different temperatures

4 結(jié) 論

利用經(jīng)典熒光法以及改進熒光法對藥物FF與BSA 之間的相互作用進行了研究，并通過紫外光譜法對后者進行了驗證。通過比較可知，與經(jīng)典熒光法相比，改進法與紫外法所得到的結(jié)合常數(shù)較大，且兩者的數(shù)值接近。這說明以藥物為檢測對象的改進熒光法能夠更全面更準確地將蛋白與藥物相互作用的信息通過熒光手段表現(xiàn)出來。兩種方法的線性擬合方程的線性相關(guān)系數(shù)值均在0.99 以上，雖然改進法與紫外法所得出的結(jié)合常數(shù)有一定的差異，但是差異較小，這也說明改進法是合理的。改進熒光法對一直被人們沿用的經(jīng)典熒光法是一個挑戰(zhàn)，為能夠更準確地研究藥物與蛋白之間的相互作用提供了新的途徑，能夠使得蛋白與藥物間的研究得到進一步完善。

［1］Liu Y M，Li G Z，Sun X F.Study on the interaction between colchicine and bovine serum albumins by fluorescence method［J］.Anal.Chem.(分析化學)，2004，32(5):615-618 (in Chinese).

［2］Smyk B.Fluorescence study of sinapic acid interatection with bovine serum albumin and egg albumin［J］.J.Fluoresc.，2003，30(3):229-233.

［3］Liu B S，Yang C，Yan X N，et al.Study on the conjugation mechamism of colistin sulfate with bovine serum albumin and effect of the metal ions on the reaction［J］.J.Lumin.，2012，132(12):1133-1138.

［4］Huang R，Xia Z N，Gong P.Study on the interaction of serum albumin and micromolecule compounds by modified fluorescence spectra［J］.Spectrosc.Spectral Anal.(光譜學與光譜分析)，2008，28(1):161-164 (in Chinese).

［5］Ding F，Chen J H，Jiang S X.Research progress in the fluprofen new antimicrobial agents［J］.China Animal Health Inspection (中國動物檢疫)，2010，27(2):66-68 (in Chinese).

［6］Liu J Q，Tian J N，Zhang J Y，et al.Interaction of magnolol with bovine serum albumin:A fluorescence-quenching study［J］.Anal.Bioanal.Chem.，2003，376(6):864-867.

［7］Liu B S，Yan X N，Yang C，et al.Studies on the interaction between norfloxacin and ofloxacin in prescence of bovine serum albumin by fluorescence spectrum methods［J］.J.Hebei Univ.(Natural Science Edition)(河北大學學報:自然科學版)，2011，31(3):262-266 (in Chinese).

［8］Li X Y.Interaction of metronidazole with bovine serum albumin by using fluorescence and resonance light scattering spectra［J］.Acta.Phys.Chim.Sinica (物理化學學報)，2007，23(2):262-267 (in Chinese).

［9］Feng X Z，Lin Z，Yang L J，et al.Investigation of the interaction between acridine orange and bovine serum albumin［J］.Talanta，1998，47(5):1223-1229.

［10］Bi S Y，Sun Y T，Qiao C Y，et al.Binding of several anti-tumor drugs to bovine serum albumin:Fluorescence study［J］.J.Lumin.，2009，129(5):541-547.

［11］Liu Y，Xie M X，Kang J.Influence of total saponins of panax notoginseng on the conformation of BSA［J］.Acta.Chim.Sinica (分析化學)，2001，61(8):1305-1310 (in Chinese).

［12］Chang X J，Huang Y，He Q.Study on the interaction between Ir(Ⅳ)and gamma seroglobulinum humanum［J］.Acta.Chim.Sinica (化學學報)，2005，63(3):223-228 (in Chinese).

［13］Song Y M，Liu Z，Wang K J，et al.Interaction of the ternary complexes with anticoagulant property of iron，copper with human serum albumin［J］.Acta.Chim.Sinica (化學學報)，2010，68(21):2191-2198 (in Chinese).

［14］Liu B S，Liu Z C，Gao J.Interaction between erythromycin and bovine serum albumins by fluorescence method［J］.J.Hebei Univ.(Natural Science Edition)(河北大學學報:自然科學版)，2005，25(4):380-382 (in Chinese).

［15］Li L W，Wang D D，Sun D Z，et al.Thermodynamic study on interaction between anti-tumor drug 5-fluorouracil and human serum albumin［J］.Acta.Chim.Sinica (化學學報)，2007，65(27):2853-2857 (in Chinese).

［16］Liu B S，Yang C，Wang J.Luminescence mechanism study of the conjugation reaction between cefpirome sulfate and bovine serum albumin［J］.Chin.J.Lumin.(發(fā)光學報)，2011，32(3):293-299 (in Chinese).

［17］Liang H，Bian H D，Tu C Q，et al.Binding equilibrium study between La(Ⅲ)and HSA or BSA［J］.Chem.J.Chin.Univ.(高等化學學報)，2001，22(1):21-25 (in Chinese).