江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所（225300）姜愛(ài)芳

奧拉西坦為吡拉西坦的類(lèi)似物，可促進(jìn)磷酰膽堿和磷酰乙醇胺合成，提高大腦中ATP/ADP的比值，使大腦中蛋白質(zhì)和核酸的合成增加。適用于腦損傷及其引起的神經(jīng)功能缺失、記憶與智能障礙等癥的治療。國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]中對(duì)其采用家兔熱原檢查法，鑒于鱟試劑用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，筆者參照《中國(guó)藥典》2010年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[2]和相關(guān)文獻(xiàn)[3][4][5]，對(duì)奧拉西坦注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)分析如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

鱟試劑（以下簡(jiǎn)稱(chēng)TAL）[批號(hào)：1206190，標(biāo)示靈敏度（λ）0.25EU/mL，0.1mL/支，10支/盒（湛江博康海洋生物有限公司）；批號(hào)：1207141，標(biāo)示靈敏度（λ）0.25EU/mL，0.1mL/支，10支/盒（湛江安度斯生物有限公司）]；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（以下簡(jiǎn)稱(chēng)BET水）[批號(hào)：2010-1，10mL/支，10支/盒（中國(guó)藥品生物制品檢定所）]；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)WSE）[批號(hào)：150601-201174，效價(jià)160EU/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所]；奧拉西坦注射液注射液[批號(hào)：111017B、120522B，規(guī)格5mL∶1g，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司]。

附表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核

附表2 奧拉西坦注射液的干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

附表3 奧拉西坦注射液注射液的干擾試驗(yàn)結(jié)果

附表4 2個(gè)批號(hào)注奧拉西坦注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

儀器設(shè)備：ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）；微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司），吸管，毛細(xì)管等均經(jīng)除熱原處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核 按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄XIE“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見(jiàn)附表1。

兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）之間，結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值（L）的確定細(xì)菌內(nèi)毒素計(jì)算公式：L＝K/M。本品為注射劑，K＝5EU?kg-1?h-1。M為6000/60＝100mg?kg-1?h-1（根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)：每日1次，每次4～6g）。限值L＝5/100＝0.05EU/mg。根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法建立的指導(dǎo)原則[6]，可將計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的1/2或1/3，最終確定限值為0.02EU/mg。

2.3 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 奧拉西坦注射液最小有效稀釋濃度（MVC）的計(jì)算公式：MVC＝λ/L，其中L為奧拉西坦注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值0.02EU/mg，λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度。目前，市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03EU/mL。則奧拉西坦注射液的對(duì)應(yīng)最小有效稀釋濃度為25mg/mL；12.5mg/mL；6.25mg/mL；3.12mg/mL；1.5m/mL。

將奧拉西坦注射液用BET水分別稀釋成濃度為100mg/mL；50mg/mL；25mg/mL；12.5mg/mL；6.25mg/mL；3.12mg/mL；1.5mg/mL的溶液，將此系列濃度溶液標(biāo)記為NPC。同時(shí)，在上述試驗(yàn)液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的試驗(yàn)溶液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列溶液為PPC。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)。每一濃度設(shè)2管，同時(shí)設(shè)陰性（NC）和陽(yáng)性（PC）對(duì)照管，混勻后封口，置37 ℃恒溫水浴60min，做干擾試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)附表2。

從附表2結(jié)果可以看出，由以上干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果可以初步了解：兩個(gè)廠家鱟試劑對(duì)奧拉西坦注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果在12.5mg/mL及以下濃度時(shí)均無(wú)干擾作用。

2.4 供試品干擾試驗(yàn)[7]用BET水將2批奧拉西坦注射液配成12.5mg/mL的溶液，用該濃度溶液和BET水分別將WSE稀釋成含內(nèi)毒素0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL的溶液，然后步驟進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)附表3。正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明：Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2.0λ）時(shí)， 2個(gè)批號(hào)含12.5mg/mL供試品的Et值均在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）范圍之間，確認(rèn)供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 將2批樣品分別用BET水稀釋成12.5mg/mL的溶液，用此濃度將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2.0λ濃度的溶液，作為供試品陽(yáng)性對(duì)照，用λ為0.25EU/mL的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)附表4。

3 討論

3.1 從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，12.5mg/mL的樣品稀釋液對(duì)標(biāo)示靈敏度為0.25EU/mL的鱟試劑無(wú)干擾作用，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法替代奧拉西坦注射液熱原檢查是可行的。2批奧拉西坦注射液熱原檢查符合規(guī)定，與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果一致。

3.2 對(duì)供品進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)，是評(píng)價(jià)藥品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝聚反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便初步篩選出對(duì)檢查無(wú)干擾的樣品濃度范圍，同時(shí)也可節(jié)約鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的用量，而且可以減少工作量。為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，采用了2個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果均滿(mǎn)意。

3.3 本文建立的奧拉西坦注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)方法可行。既為臨床安全用藥提供技術(shù)依據(jù)，又為完善藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。