，， ，長保，魚海，

(1.廣東省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院)

口蹄疫(FMD)是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的通報性動物疫病，我國列為一類動物傳染病。OIE最近通報了口蹄疫的發(fā)病狀況，除O型持續(xù)流行外，還存在A型口蹄疫。牛、豬、山羊和綿羊均可能感染發(fā)病，因此對養(yǎng)殖業(yè)危害極大。我國主要采用ELISA、RT-PCR、血凝抑制試驗(yàn)(HIT)和病毒分離等方法進(jìn)行檢疫處理。

膠體金免疫層析分析(GICA)是一種適用于野外作業(yè)的新型口蹄疫抗體快速檢測診斷技術(shù)，具有快速簡便、結(jié)果可靠等特點(diǎn)[1-7]。本研究利用合成肽表面展示技術(shù)，進(jìn)行口蹄疫抗體快速檢測卡研制與應(yīng)用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1合成肽重組復(fù)合體 設(shè)計(jì)合成肽基因HXT5[8-9]，經(jīng)T4噬菌體表面展示構(gòu)建合成肽重組復(fù)合體。

1.2血清和試劑 豬O型FMD、豬水泡病陽性和陰性血清，以及HIT檢測試劑由農(nóng)業(yè)部蘭州獸醫(yī)研究所提供。藍(lán)耳病和豬瘟陽性血清由農(nóng)業(yè)部哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。臨床血清檢測樣品由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存。雞抗FMDV血清(一抗)和羊抗雞IgG(二抗)由珠海某生物技術(shù)有限公司提供。

1.3膠體金制備和標(biāo)記 將0.01%氯金酸100 mL加熱，冷凝后用0.2 M K2CO3調(diào)pH值至6.0，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。制備好的膠體金溶液與一定濃度的合成肽重組復(fù)合體偶聯(lián)，制成檢測卡，用塑料袋真空包裝備用。

1.4結(jié)果判定和評價 將待檢血清樣品添加在樣品墊，向吸水墊方向移動，經(jīng)硝酸纖維素膜條層析，與標(biāo)記膜(C、T)上的抗原反應(yīng)，由膠體金濃縮顯色。添加水泡病、藍(lán)耳病和豬瘟陽性血清進(jìn)行特異性評價，將FMD陽性血清倍比稀釋進(jìn)行敏感性測定，檢測卡在室溫保存一定時間觀察穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1合成肽設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)O型FMDV RGD決定簇122個氨基酸序列(圖1)，基因合成后用于T4噬菌體表面展示。

GECRYNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTLRHKQKIVAPVKQGSSK

YGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPGRHKQKIVAPAKQQFELEF

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圖1 用于GICA測定口蹄疫抗體的合成肽氨基酸序列

2.2膠體金制備 蔗糖梯度離心獲得重組噬菌體用于包被，采用正交方式優(yōu)化配比，紅色(圖2：A)和黑色(圖2：B)膠體金顆粒GICA測定口蹄疫抗體取得良好的顯色效果(圖2：T)，陰性血清不顯色。

圖2 不同顏色膠體金顆粒GICA測定口蹄疫抗體的顯色效果

2.3評價試驗(yàn) 取研制檢測卡，分別用豬水泡病、豬藍(lán)耳病、豬瘟陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均未出現(xiàn)陽性信號，表明所研制的試劑盒特異性良好。

2.4半定量測定 陽性血清倍比稀釋后檢測靈敏度達(dá)到1∶512(圖3:D)，與HIT檢測結(jié)果相同。

圖3 GICA測定口蹄疫抗體血清倍比稀釋出現(xiàn)的顏色梯度反應(yīng)

2.5田間樣品檢測 隨機(jī)采集經(jīng)O型合成肽疫苗和滅活疫苗接種的兩豬群血清，應(yīng)用檢測卡測試，陽性率分別達(dá)85.7%和92.0%(表1)。

表1 GICA試紙條檢測豬乙型腦炎抗體不同豬群檢測結(jié)果

3 討論

FMD具有急性高度接觸性傳染特點(diǎn)，可同時感染牛、羊、豬等偶蹄動物。目前流行O型和A型等不同血清型病毒，免疫接種是主要的防控措施。畜群FMD抗體水平越高，則免疫保護(hù)力越強(qiáng)[2]。因此，對抗體水平進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測是免疫防控策略的重要組成部分。中和試驗(yàn)、ELISA、DIVA、HIF等常規(guī)的血清抗體檢測方法，都需要一定的儀器設(shè)備和操作技能，檢測時間較長，不能滿足基層單位的應(yīng)用需求。而GICA已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可顯色肉眼判定結(jié)果，準(zhǔn)確可靠；無需儀器，基層單位應(yīng)用方便；常溫運(yùn)輸和保存，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本研究采用新型GICA方法檢測FMD抗體獲得成功，值得推廣應(yīng)用。

FMD合成肽疫苗采用肽段疊加和添加載體構(gòu)建復(fù)合物，生物活性顯著增強(qiáng)[8]。本研究以噬菌體載體進(jìn)行活性肽多拷貝表面展示，復(fù)合物在GICA中顯示出類似全病毒的免疫活性。純化的重組顆粒大小一致，與合適的膠體金顆粒吸附良好，穩(wěn)定性高。用于體外診斷可以避免噬菌體載體本身對機(jī)體產(chǎn)生毒性和免疫抑制作用，與常規(guī)全病毒和原核表達(dá)抗原GICA比較，具有更好的生物安全性，成本更加低廉，綠色環(huán)保，無毒副作用。

FMDV具有VP1 G-H loop結(jié)構(gòu)，包含病毒主要抗原位點(diǎn)，在合成肽疫苗中可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫[9]。本研究合成肽包含重要的O型FMDV RGD決定簇，表面展示復(fù)合體用于GICA檢測FMD抗體，與豬瘟、豬水泡病、藍(lán)耳病陽性血清無交叉反應(yīng)，特異性良好，敏感性與正向間凝相當(dāng)，用于半定量測定穩(wěn)定性好，可重復(fù)性強(qiáng)。制備的試劑盒在FMD免疫檢測和感染抗體快速檢測中具有廣泛應(yīng)用前景。

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