黃曉麗 王國(guó)品 王平 湯玉蓉 滕曉琨 葛建新

羅格列酮對(duì)急性高脂血癥性胰腺炎大鼠干預(yù)研究

黃曉麗 王國(guó)品 王平 湯玉蓉 滕曉琨 葛建新

隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，高脂血癥性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis,HLP)的發(fā)病率逐年升高，且HLP患者較非HLP患者的癥狀重、并發(fā)癥多、預(yù)后差。高脂血癥患者往往伴有體內(nèi)脂肪組織增多，脂肪組織可釋放脂肪細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為重要的脂肪因子之一，在HLP 中發(fā)揮重要作用。羅格列酮為選擇性過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ)激動(dòng)劑，具有增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗等藥理作用，在炎癥調(diào)控中也起到一定作用 。本研究應(yīng)用羅格列酮干預(yù)HLP和非HLP大鼠，觀察胰腺組織TNF-α表達(dá)的變化，探討羅格列酮保護(hù)HLP大鼠的作用機(jī)制。

一、材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：雄性SD大鼠48只，體重200～250 g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。按數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組8只。對(duì)照組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)4周，開(kāi)腹輕輕翻動(dòng)十二指腸和胰腺后即關(guān)腹。高脂血癥(HL)組大鼠用高脂飼料(77%普通飼料+20%豬油+3%膽固醇)喂養(yǎng)4周，術(shù)中亦僅輕輕翻動(dòng)十二指腸和胰腺。非HLP(NHLP)組大鼠用普通飼料喂養(yǎng)4周，采用5%牛黃膽酸溶液(Sigma公司)逆行注入胰膽管方法制備急性壞死性胰腺炎(ANP)模型。HLP組大鼠用高脂飼料喂養(yǎng)4周后同法制備ANP模型。NHLP及HLP治療組在NHLP及HLP大鼠造模后經(jīng)股靜脈注射10%DMSO溶解的羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司)6 mg/kg體重。其他4組在術(shù)后經(jīng)股靜脈注射等容積生理鹽水。術(shù)后12 h處死動(dòng)物，取胰腺組織和血標(biāo)本。

2．胰腺組織病理學(xué)檢查：取部分胰腺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、制片、HE染色，由2名病理醫(yī)師讀片，每片選取4個(gè)視野，根據(jù)Schmidt等[1]的標(biāo)準(zhǔn)從水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、壞死4個(gè)方面評(píng)分，取均值，各單項(xiàng)平均分之和為病理總分。

3．血清TNF-α、三酰甘油(TG)和淀粉酶活性測(cè)定：ELISA法測(cè)定血清TNF-α水平，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TG水平及淀粉酶活性。

4．胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè)：取100 mg新鮮胰腺組織，加入1 ml Trizol(Invitrogen公司)抽提總RNA，先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和Oligo(dT)引物(Promega公司)合成第一鏈cDNA。再取1 μl cDNA為模板，用PCR試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列：TNF-α(210 bp)上游5′-TAGCAAACCACCAAGCAG-3，下游：5′-GGTATGAAATGGCAAATCG-3′，內(nèi)參GAPDH(470 bp)上游5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游5′-ACCAGTGGATGCAGGGAT-3′。PCR反應(yīng)條件： 95℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃ 35 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離、溴化乙啶染色，在凝膠影像分析儀(Bio-Rad ChemiDoc XRS)上成像并掃描，以TNF-α與GAPDH吸光度比值表示mRNA的表達(dá)水平。

二、結(jié)果

1．胰腺組織病理學(xué)改變：對(duì)照組胰腺組織無(wú)明顯改變。HL組胰腺的部分細(xì)胞脂質(zhì)空泡形成，中等量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯出血及壞死。NHLP組與HLP組胰腺實(shí)質(zhì)大量壞死伴出血，間質(zhì)顯著充血、水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。NHLP治療組與HLP治療組胰腺實(shí)質(zhì)壞死、出血、間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較相應(yīng)未治療組減輕(圖1)。NHLP組和HLP組胰腺病理評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P值均<0.01)，HLP組評(píng)分又顯著高于NHLP組及HL組(P<0.05、P<0.01)，NHLP治療組評(píng)分顯著低于NHLP組(P<0.05)，HLP治療組顯著低于HLP組(P<0.01，表1)。

2．血清TG及淀粉酶水平的變化：HL組及HLP組血TG濃度顯著高于對(duì)照組(P值均<0.01)，但羅格列酮治療不降低血TG的水平。HL組與對(duì)照組的血淀粉酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NHLP組、NHLP治療組、HLP組、HLP治療組血淀粉酶活性均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.01)，且HLP組亦顯著高于HL組(P<0.05，表1)。羅格列酮治療能顯著降低HLP組的血淀粉酶活性，但不降低NHLP組血淀粉酶活性。

圖1對(duì)照組(a)、HL組(b)、NHLP組(c)、NHLP治療組(d)、HLP組(e)、HLP治療組(f)的胰腺病理改變(HE ×100)

3．血清TNF-α濃度的變化：HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組血TNF-α濃度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)，且NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組血TNF-α濃度均顯著高于HL組(P值均<0.01，表1)。羅格列酮治療能顯著降低NHLP組及HLP組的血TNF-α濃度。

表1 各組大鼠血清TG、淀粉酶、TNF-α水平及胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HL組比較，cP<0.05，dP<0.01；與NHLP組比較，eP<0.05，fP<0.01；與HLP組比較，gP<0.05，hP<0.01

4．胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)水平的變化：對(duì)照組、HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)水平分別為0.72±0.13、1.00±0.19、1.22±0.08、1.66±0.11、1.06±0.15、1.38±0.07(圖2)。HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，且HLP組亦顯著高于HL組(P值均<0.05)，羅格列酮治療能顯著下調(diào)HLP組胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)(P<0.05)，但NHLP治療組與NHLP組胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2對(duì)照組(1)、NHLP治療組(2)、NHLP組(3)、HL組(4)、HLP治療組(5)、HLP組(6)大鼠胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)

討論TNF-α來(lái)源廣泛，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，另外脂肪組織亦高表達(dá)TNF-α。文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，TNF-α與急性胰腺炎的發(fā)病密切相關(guān)。劉梅芳等[4]研究顯示，TNF-α能夠上調(diào)脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪分化相關(guān)蛋白，并增加其磷酸化水平，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解，釋放大量脂肪酸(FFA)，加重胰腺損傷。Suganami等[5]體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)FA又可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。因此，HLP大鼠體內(nèi)形成FFA和TNF-α之間的惡性循環(huán)，導(dǎo)致脂肪酸和TNF-α大量釋放，而兩者均可加重胰腺損傷。本研究結(jié)果顯示，NHLP組和HLP組胰腺病理組織學(xué)評(píng)分、血清淀粉酶活性明顯高于對(duì)照組及HL組，HLP組和HL組血TG水平明顯高于對(duì)照組，提示制模成功。HL組大鼠血TNF-α濃度及胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組大鼠，HLP組大鼠胰腺病理?yè)p傷較NHLP組重，血清TNF-α濃度及胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)均顯著高于NHLP組，提示HLP大鼠胰腺組織TNF-α高表達(dá)及血清TNF-α水平升高是HLP時(shí)胰腺損傷加重的重要原因之一。

羅格列酮是高選擇性PPAR-γ激動(dòng)劑。有研究發(fā)現(xiàn)，激活PPAR-γ可以阻止脂多糖引起的單核細(xì)胞、HL60細(xì)胞與人體動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而抑制TNF-α等致炎細(xì)胞因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[6]。Hao等[7]報(bào)道，羅格列酮通過(guò)活化PPAR-γ，抑制了JAK-STAT信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制TNF-α mRNA的表達(dá)，減輕胰腺的病變損傷。Pini等[8]認(rèn)為，羅格列酮能通過(guò)降低伴急性胰腺炎的肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪皂化和減輕紅細(xì)胞生成抑制而提高大鼠的生存率、促進(jìn)胰腺炎癥恢復(fù)，但能促進(jìn)伴急性胰腺炎的非肥胖大鼠胰腺腺泡和脂肪組織的壞死。本研究結(jié)果顯示，HLP大鼠經(jīng)羅格列酮治療后胰腺病理學(xué)評(píng)分、血清TNF-α濃度、胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低，而NHLP大鼠經(jīng)羅格列酮治療后血清TNF-α濃度顯著降低，但胰腺病理組織學(xué)評(píng)分及胰腺組織TNF-α mRNA表達(dá)的下降不明顯，提示羅格列酮對(duì)HLP的治療效果較NHLP強(qiáng)，為臨床應(yīng)用此藥提供一定的幫助。

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2013-01-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.020

南通大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(10Z12)

210048 南京，南通大學(xué)附屬南京江北人民醫(yī)院消化內(nèi)科

黃曉麗，Email：h_xiaoli2012@163.com