孫高峰 左長京 汪建華 張建 馬超 李曉棟 彭燁 潘桂霞 茅娟莉 郝俊 馮曉源

·論著·

巴馬小型豬輕度慢性胰腺炎代謝特征分析

孫高峰 左長京 汪建華 張建 馬超 李曉棟 彭燁 潘桂霞 茅娟莉 郝俊 馮曉源

目的應(yīng)用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)磁共振(HR-MAS NMR)波譜分析巴馬小型豬阻塞性慢性胰腺炎(CP)早期的代謝變化特征。方法39頭巴馬小型豬按隨機數(shù)字表法分為對照組和CP組。采用主胰管近端不全結(jié)扎法制備CP模型，對照組僅開腹翻動胰腺及腸道后關(guān)腹。造模后第4、8、12周分批處死動物，獲取胰腺組織。根據(jù)胰腺纖維化程度，將CP分為輕、中、重度。應(yīng)用HR-MAS NMR波譜分析輕度CP組和對照組胰腺組織的代謝特征。結(jié)果制模成功的24頭巴馬小型豬的胰腺組織經(jīng)病理檢查為輕度10頭，中度5頭，重度7頭。經(jīng)HR-MAS NMR波譜分析，輕度CP組胰腺組織的代謝產(chǎn)物中膽堿、甘氨酸、甜菜堿、乳酸、脂肪酸、磷酸膽堿/甘油磷酸膽堿峰值與對照組有差異，其中膽堿波峰顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(5.02±1.96 比1.56±0.79,P<0.01)，而其他5種代謝產(chǎn)物峰的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論與對照組比較，巴馬小型豬輕度CP胰腺組織的膽堿波峰強度顯著增高，這可能是區(qū)分正常和早期CP的標志。

胰腺炎，慢性； 模型，動物； 磁共振波譜學(xué)； 代謝

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是指各種病因引起的胰腺組織和功能不可逆的慢性炎癥性疾病，其病理特征為胰腺腺泡萎縮、破壞和間質(zhì)纖維化[1-2]。迄今為止，CP的病因及發(fā)病機制仍不甚清楚。在CP發(fā)病初期，代謝異常會先于組織學(xué)和形態(tài)學(xué)發(fā)生改變之前出現(xiàn)，因此，對發(fā)病初期的代謝研究能幫助我們更好地了解CP的病理生理學(xué)發(fā)展過程和進行早期診斷。本研究通過對巴馬小型豬正常胰腺組織和輕度CP胰腺組織的主要代謝產(chǎn)物的分析，探討巴馬小型豬輕度阻塞性CP代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。

材料與方法

一、實驗動物及分組

雌性巴馬小型豬39頭，月齡6～10個月，體重12.5～20 kg，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，使用許可證SYXK(滬)2007-0003，生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2005-0002。實驗動物在實驗動物中心的清潔級環(huán)境及標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗前24 h禁食，6 h禁水。按照隨機數(shù)字表法分為慢性胰腺炎(CP)組(27頭)和正常對照組(12頭)。采用文獻[3]的方法建立小型豬阻塞性CP模型。對照組僅開腹翻動胰腺及腸道后關(guān)腹。術(shù)后腹帶固定，按照標準喂養(yǎng)。術(shù)后第4、8、12周分批處死動物，取胰腺組織，部分10%甲醛固定，部分儲存于液氮罐內(nèi)備用。

二、胰腺組織病理學(xué)檢查

取固定的胰腺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。由3位高年資病理學(xué)專家采用雙盲法讀片，并按Stolte等[4]的方法對CP進行分期，即按照胰腺纖維化和腺泡萎縮程度定義CP，并根據(jù)纖維化程度將CP分為3期：Ⅰ期(輕度)，表現(xiàn)為輕微纖維化，即纖維化分布以小葉周圍為主，可見較多淋巴細胞、漿細胞浸潤；Ⅱ期( 中度)，表現(xiàn)為中度纖維化，纖維化擴展到小葉內(nèi)、腺泡之間，間質(zhì)內(nèi)可見較多淋巴細胞、漿細胞浸潤；Ⅲ期(重度)，表現(xiàn)為重度纖維化和極重度纖維化，小葉內(nèi)的纖維化相互融合，形成較大面積的纖維化或者廣泛的纖維化形成，致使胰腺的外分泌實質(zhì)幾乎完全被破壞，間質(zhì)內(nèi)仍可見淋巴細胞、漿細胞浸潤，但浸潤的細胞數(shù)量較Ⅱ期減少。應(yīng)用改良Van Gieson膠原纖維染色法行VG染色，觀察胰腺組織纖維化程度。

三、1H-磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)檢測及分析

取保存于液氮的胰腺組織，經(jīng)重水淋洗后，取約15 mg裝入4 mm的附帶球形內(nèi)腔的ZrO2轉(zhuǎn)子，在Bruker AVANCE-600波譜儀上進行檢測。1H-MRS共振頻率為 600.13 MHz。測試用探頭為雙共振高分辨魔角旋轉(zhuǎn)頭(high-resolution magic angle spinning, HR-MAS)，魔角轉(zhuǎn)速為5 kHz，測試溫度300.0 K。譜圖采樣點數(shù)65 k，譜寬20 ppm，弛豫延遲2 s，累加次數(shù)160次，自由感應(yīng)衰減(free induction decay，F(xiàn)ID)信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)為1H-核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)譜圖，化學(xué)位移以TSPδ0定標并校對相位。CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列總的自旋回波時間為180 ms。同時，根據(jù)二維J分解實驗、異核單量子相關(guān)譜、全相關(guān)譜(total correlation spectroscopy, TOCSY)、可核化學(xué)位移相關(guān)譜及相關(guān)文獻來確認1H譜的譜峰指認，由CPMG測得的一維1H譜數(shù)據(jù)被用于進行主成分(principal componenps analysis, PCA)分析。

四、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、巴馬小型豬阻塞性CP模型建立

CP組因麻醉意外死亡1頭，肺部感染及腹腔感染死亡各1頭，存活24頭。經(jīng)CP病理分期為輕度10頭，中度5頭，重度7頭(圖1)，2頭胰腺無纖維化。對照組12頭豬的胰腺無纖維化，病理分期均為0期。但其中3頭CT檢查提示有肺炎，考慮到不能確定炎癥是否會影響波譜分析的結(jié)果，所以予以剔除。

圖1正常胰腺(a)、輕度CP(b)、中度CP(c)、重度CP(d)的病理改變(上)及纖維組織染色(下) (HE，VG ×100)

二、高分辨魔角旋轉(zhuǎn)頭核磁共振(HR-MAS NMR)譜圖分析

比較對照組和輕度CP組胰腺的HR-MAS MRS譜圖(圖2)，發(fā)現(xiàn)6種含量有差異的代謝產(chǎn)物：乳酸(Lactate, Lac)、甜菜堿(Betaine, Bet)、甘氨酸(Glycine, Gly)、脂肪酸(Fatty acid, FA)、磷酸膽堿/甘油磷酸膽堿(Phosphpcholine and Glycero-phosphocholine, PC/GPC)、膽堿(Choline, Cho)，其中輕度CP組的膽堿含量較對照組增加最明顯。

通過PCA分析得到的得分圖(圖3a)顯示對照組與輕度CP組處于不同的區(qū)域，沒有重疊部分，而且數(shù)據(jù)點分布較為緊密，兩組差異明顯。負載圖(圖3b)顯示代謝物乳酸、甜菜堿、甘氨酸、脂肪酸、磷酸膽堿/甘油磷酸膽堿、膽堿發(fā)生化學(xué)易位。

圖2輕度CP組(a)和對照組胰腺(b)的HR-MAS NMR譜

圖3由NMR CPMG1H譜圖獲得的9.00-0.05得分圖(a)及負載圖(b)

對照組及輕度CP組不同代謝產(chǎn)物積分面積見表1。與對照組比較，輕度CP組代謝產(chǎn)物中僅有膽堿含量顯著增加(P<0.01)，而其他5種代謝產(chǎn)物差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 兩組胰腺主要代謝產(chǎn)物的積分面積

注：a為方差齊性分析，其他為方差不齊性分析

討 論

目前，穿刺活檢是診斷CP的金標準，但胰腺穿刺難度大，具有一定的風(fēng)險，可能引起胰漏、急性胰腺炎等嚴重的并發(fā)癥[5-6]。CT、MRI等影像學(xué)檢查能夠?qū)χ囟菴P做出正確的診斷，但對輕度CP診斷幫助不大。

近年來隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，許多學(xué)者成功地通過磁共振波譜技術(shù)研究各種疾病早期代謝產(chǎn)物的改變，從而揭示疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律。在CP發(fā)病過程中，代謝異常也發(fā)生在功能異常之前，因此，檢測代謝物水平異常能夠從更高層次了解CP的病理生理機制，從而能夠幫助CP的早期診斷[7]。

本研究結(jié)果顯示，輕度CP小型豬胰腺組織與正常小型豬胰腺組織存在6種有差異的代謝產(chǎn)物——乳酸、甜菜堿、甘氨酸、脂肪酸、磷酸膽堿/甘油磷酸膽堿、膽堿，其中只有膽堿顯著高于正常胰腺，而其他5種代謝產(chǎn)物變化的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

膽堿通常被作為多種癌癥的腫瘤生物化學(xué)標志物。因為腫瘤細胞分裂旺盛，細胞膜合成增加，所以膽堿含量增加[8-9]。由于通常的魔角旋轉(zhuǎn)速率低于6 kHz，遠小于細胞膜分子之間的偶極-偶極相互作用，膜結(jié)合狀態(tài)的膽堿不大可能被檢測到[10-11]。因此，本研究中所測得的膽堿主要是胰腺組織中的自由分子，它主要來自于磷脂代謝。作為活性代謝物的游離膽堿在正常組織中濃度較低，含量增加則反映了細胞膜合成增加或細胞增殖加快。

甘氨酸是生物體內(nèi)固有的、最簡單的氨基酸，參與體內(nèi)多種活性物質(zhì)的合成。劉靖等[12]的研究表明，甘氨酸有改善脂質(zhì)代謝的作用。本研究結(jié)果顯示，甘氨酸的含量無明顯變化，提示在CP早期胰腺組織的脂質(zhì)代謝尚未出現(xiàn)紊亂，作為脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的脂肪酸水平也未出現(xiàn)異常，從另一方面也支持了這一推測。

乳酸的出現(xiàn)代表糖酵解增多。本研究結(jié)果顯示，輕度CP胰腺組織的乳酸水平無顯著變化，表明糖代謝未出現(xiàn)紊亂。當(dāng)然，離體組織標本取樣和冷凍過程中不可避免地會發(fā)生無氧酵解，導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生，因此，乳酸并不適合作為辨別兩者的生物化學(xué)標志物。

膽堿和甜菜堿是生物體內(nèi)重要的活性甲基供體，均在脂肪代謝過程中發(fā)揮重要作用，而且膽堿是甜菜堿的前驅(qū)體，經(jīng)過二次氧化后可以生成甜菜堿，膽堿的升高理應(yīng)造成甜菜堿的升高。但本研究中膽堿明顯升高而甜菜堿無明顯變化，推測可能是由于CP早期發(fā)生的炎性反應(yīng)導(dǎo)致細胞增生，而膽堿作為細胞膜磷脂的組成部分維護細胞基本結(jié)構(gòu)和功能的作用是甜菜堿所不能替代的，因此，在CP早期，雖然三大代謝未出現(xiàn)障礙，但炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細胞膜損傷和細胞反應(yīng)性增生已經(jīng)出現(xiàn)，最終導(dǎo)致膽堿水平單獨升高。 總之，在CP早期，胰腺的糖、脂肪和氨基酸三大代謝產(chǎn)物均未出現(xiàn)明顯變化，而膽堿水平的增高可能是一種具有保護作用的應(yīng)激性升高，提示在CP早期有可能最先出現(xiàn)的是胰腺組成細胞的損傷和增生修復(fù)。

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MetaboliccharacteristicsofmildchronicpancreatitisinBamaminiatureswine

SUNGao-feng,ZUOChang-jing,WANGJian-hua,ZHANGJian,MAChao,LIXiao-dong,PENGYe,PANGui-xia,MAOJuan-li,HAOJun,FENGXiao-yuan.

DepartmentofNuclearMedicine,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

FENGXiao-yuan,Email:xyfeng@shmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the metabolic characteristics of early stage of obstructive chronic pancreatitis (CP) in swine by high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (HR-MAS NMR) spectroscopy.MethodsA total of 39 Bama miniature swine were randomly divided into CP group and control group. The pancreatic main duct (PMD) of the swine in the experimental group underwent partial proximal ligation procedure. The swine in the control group underwent opening the abdomen and rubbing the pancreas and intestine. At the 4th, 8th and 12th week after the operation, the swine were sacrificed to harvest the pancreas tissue for pathologically examination, which were classified as mild, moderate and severe according to the degree of fibrosis. The metabolic profiles from the pancreas of normal swine and mild CP swine were examined by using HR-MAS NMR spectroscopy.ResultsCP model was successfully established in 24 Bama miniature swine, and pathologically examination showed 10 was mild, 5 was moderate and 7 was severe. Among the metabolites in mild CP, HR-MAS NMR analysis suggested that the peak of choline, glycine, betaine, lactate, fatty acid, phosphorylcholine/choline glycerophosphate was different with those in normal pancreas, and only the difference of choline was statistically significant (5.02±1.96vs1.56±0.79,P<0.01), while the difference of other 5 metabolites was not statistically significant.ConclusionsCompared with control group, mild CP in Bama miniature swine shows significantly increased choline, and this may be a marker for discrimination of normal and early CP.

Pancreatitis, chronic； Models, animal; Magnetic resonance spectroscopy; Metabolism

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.010

國家自然科學(xué)基金(81170435)；上海市科委基金(10410708800)；中國博士后科學(xué)基金(20100480545)；上海市領(lǐng)軍人才隊伍建設(shè)專項資金(2011-036)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科(孫高峰、左長京、張建、彭燁、潘桂霞、茅娟莉)，放射科(馬超)，胰腺外科(郝俊)；寧波大學(xué)附屬醫(yī)院放射科(汪建華)；河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心(李曉棟)；上海華山醫(yī)院放射科(馮曉源)

馮曉源，Email: xyfeng@shmu.edu.cn

2013-03-28)

(本文編輯：呂芳萍)