楊紅 路新卿 李驥 朱永健 丁輝 王健 胡益群 鄧衛(wèi)萍 錢家鳴

·論著·

ARHI基因轉染PANC1細胞后對細胞凋亡和自噬相關基因表達譜的影響

楊紅 路新卿 李驥 朱永健 丁輝 王健 胡益群 鄧衛(wèi)萍 錢家鳴

目的觀察ARHI基因轉染PANC1細胞后對細胞凋亡和自噬相關基因mRNA表達譜的影響。方法采用脂質體法將表達ARHI基因的質粒pIRES2-EGFP-ARHI、空質粒pIRES2-EGFP轉染胰腺癌PANC1細胞。采用基因芯片RT2ProfilerTMPCR Array行實時定量PCR，分析轉染細胞的基因表達譜，包括84個與凋亡和自噬相關基因。結果ARHI基因轉染組PANC1細胞有9個基因mRNA表達下調，38個基因mRNA表達上調，37個基因mRNA表達變化無意義。在與凋亡相關的基因中有8個促凋亡基因表達顯著上調(>6倍)，主要為TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡結構域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上調尤為明顯，達42.83倍；抗凋亡基因中3個基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)表達顯著上調(>6倍)，3個基因(BCL2、BAD、BAG4)表達輕度上調(>2倍)，1個基因(BCL2L1)表達輕度下調(<-2倍)。在與自噬相關的基因中3個促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表達顯著上調(>6倍)，4個基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表達輕度上調(>2倍)；3個抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表達輕度上調(>2倍)，1個基因(MCL1)表達輕度下調(<-2倍)。結論ARHI基因顯著上調細胞凋亡及自噬重要調控基因Caspase-8 和DAPK1。

胰腺腫瘤； 細胞凋亡； 自噬； 基因表達； ARHI gene

胰腺癌的癌變過程是癌基因突變和抑癌基因失活的累積過程。由于胰腺位于后腹膜，活檢取組織不易，故其分子生物學研究還存在很多空白。ARHI基因是胰腺癌抑癌基因。本研究組以往的研究結果顯示[1-2]，ARHI蛋白在正常胰腺組織中廣泛表達，但在胰腺癌組織中表達下調，ARHI基因可以誘導胰腺癌細胞凋亡和細胞自噬，而細胞凋亡和自噬與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究應用基因芯片高通量檢測84個與凋亡和自噬相關基因，探討ARHI基因促進胰腺癌細胞凋亡、誘導自噬的相關分子通路。

材料與方法

一、胰腺癌細胞株及質粒轉染

胰腺癌細胞株PANC1來源于ATCC(American type culture collection)。常規(guī)培養(yǎng)并傳代。取對數生長期細胞接種于6孔板，待細胞融合度達70%～80%時分為實驗組、空質粒組、脂質體組和親本PANC1細胞對照組(對照組)，每組3個復孔，采用脂質體法(Lipofectamine 2000, Invitrogen公司)分別轉染表達ARHI基因的質粒pIRES2-EGFP-ARHI、空質粒pIRES2-EGFP、單加脂質體和常規(guī)培養(yǎng)液。轉染后2 d，培養(yǎng)液中加入終濃度為900 μg/ml的G418 (Gibco公司)篩選14 d，建立穩(wěn)定轉染的PANC1細胞株，具體步驟見文獻[2]。

二、實時定量PCR芯片檢測

收集各組細胞，采用Trizol(Gibro 公司)提取細胞總RNA，應用Promerga試劑盒逆轉成cDNA。實時定量PCR芯片(RT2ProfilerTMPCR Array)購自美國SABioscience公司，包含84個基因，有TNF/TNFR家族、BCL2/BAG家族、BIR家族、CARD家族、死亡家族、TRAF家族和caspase及相關家族等。PCR反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，循環(huán)40次。通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值。所有檢測均設3個平行管，三平行管的Ct值差距<0.5為有效數據，取其平均Ct值。以β-actin為內參照。依據2-△△Ct公式，以空質粒組為基準計算基因相對表達量。>2倍為輕度上調，>6倍為顯著上調；<-2倍為輕度下調，<-6倍為顯著下調。

結 果

一、凋亡及自噬相關基因表達譜的變化

與空質粒轉染細胞比較，實驗組PANC1細胞有9個基因mRNA表達下調，38個基因mRNA表達上調，37個基因mRNA表達變化無意義。上調基因較明顯的是TNFSF/TFNRSF家族成員、死亡結構域和死亡效應結構域家族成員、CIDE家族成員。TRAF家族表達改變不顯著。在凋亡的決定基因家族中，Caspase家族中凋亡啟動基因Caspase 8、Caspase 10明顯上調，而BCL-2家族基因表達改變不顯著。此外p53和DNA損傷反應相關基因的表達改變亦不顯著(表1)。

二、ARHI基因對PANC1細胞凋亡相關基因表達的影響

基因芯片中有58個促凋亡基因和26個抗凋亡基因，其中8個促凋亡基因表達顯著上調(>6倍)，主要為TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡結構域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上調尤為明顯，達42.83倍；3個抗凋亡基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)顯著上調(>6倍，圖1)，3個基因(BCL2、BAD、BAG4)表達輕度上調(>2倍)，1個基因(BCL2L1)表達輕度下調(<-2倍)。

圖1 ARHI基因轉染后PANC1細胞與凋亡相關基因的表達

基因表達倍數基因表達倍數基因表達倍數TNFLigand家族CD40LG(TNFSF5)4.66FASLG(TNFSF6)1.87LTA2.62TNF1.65TNFSF102.03CD701.69TNFSF819.74TNF受體家族CD40(TNFRSF5)1.11FAS(TNFRSF6)2.62LTBR1.04TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF1BTNFRSF211.39TNFRSF25-1.10CD276.86TNFRSF96.98BCL-1家族BAD2.58BAG11.39BAG31.06BAG42.39BAK1-1.76BAX-1.74BCL22.73BCL2A1-2.61BCL2L1-2.34BCL2L107.42BCL2L11-1.24BCL2L21.14BCLAF14.25BID1.51BIK3.43BNIP12.58BNIP21.82BNIP32.12BNIP3L1.01HRK4.18MCL1-2.06Caspase家族CASP1-1.96CASP1010.15CASP142.34CASP2-1.19CASP3-1.43CASP4-1.16CASP5-3.43CASP6-2.13CASP7-1.45CASP85.91CASP9-1.02IAP家族NAIP1.75BIRC22.93BIRC31.98BIRC418.34BIRC61.16BIRC85.13TRAF家族TRAF2-2.47TRAF3-1.18TRAF4-1.78CARD家族APAF12.34BCL101.73BIRC22.93BIRC31.98NOD11.13CARD63.72CARD83.04CASP1-1.96CASP2-1.19CASP41.16CASP5-3.43CASP9-1.02CRADD1.81NOL31.78PYCARD2.41RIPK21.20死亡區(qū)域家族CRADD1.81DAPK142.83FADD2.11FAS2.62TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF211.39TNFRSF25-1.10TRADD-1.75死亡效應區(qū)域家族CASP85.91CASP1010.15CFLAR3.98FADD2.11CIDE區(qū)域家族CIDEA4.32CIDEB4.08DFFA6.13P53和DNA損傷反應ABL1-1.69AKT1-1.89APAF12.34BAD2.58BAX-1.74BCL22.73BCL2L1-2.34BID-1.51CASP3-1.43CASP6-2.31CASP7-1.45CASP9-1.02GADD45A2.62TP534.12TP53BP24.55TP739.62其他BFAR5.61NAIP1.75BRAF1.30CFLAR3.98DFFA6.13IGF1R1.37LTBR1.04TNF1.65CD276.86

三、ARHI基因對PANC1細胞自噬相關基因表達的影響

3個促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表達顯著上調(>6倍)，4個基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表達輕度上調(>2倍)，2個Caspase基因(CASP3、CASP9)表達略下調；3個抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表達輕度上調(>2倍)，1個基因(MCL1)表達輕度下調(<-2倍)，AKT1、TNF基因表達改變不明顯(圖2)。

圖2 ARHI基因轉染后PANC1細胞與自噬相關基因的表達

討 論

上世紀90年代研究者就提出細胞增殖和凋亡之間的失衡造成了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近幾年又提出了自噬的概念[3-4]。自噬為凋亡所需，通常先于凋亡進而啟動凋亡。自噬可保護細胞免于發(fā)生凋亡和壞死，也可以向凋亡轉化，共同促進細胞死亡。自噬和細胞凋亡之間存在錯綜復雜的關系，可以通過不同的信號轉導途徑發(fā)揮作用，也可能它們的上游存在相同的信號通路，但在不同的因素影響下調控著兩個程序不同的方向。

文獻報道[5-7]細胞凋亡分為外源性途徑和內源性途徑。內源性途徑稱為線粒體途徑，其主要通過p53、BCL-2家族協(xié)助啟動凋亡信號。外源性途徑稱為死亡受體途徑，通過死亡功能結構域相關蛋白TRADD和FADD的結合，激活Caspase級聯(lián)反應從而促進細胞凋亡。本研究結果顯示ARHI基因轉染細胞后顯著上調TNFR/TNFSR家族基因、死亡結構域家族基因和CASP家族基因，對p53和DNA損傷反應基因及BCL-2家族基因的表達無顯著影響，提示ARHI基因通過上調TNFR受體促進死亡結構域基因的上調(DAPK1)，進而激活Caspase-8啟動Caspase級聯(lián)反應，從而促進細胞凋亡，即為外源性途徑。

DAPK1基因是與細胞骨架相關的鈣/鈣調素調節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是p53依賴的細胞轉化的關鍵基因，也是細胞轉移的抑制劑。該基因可以激活Caspase8而活化Caspase級聯(lián)反應，促動細胞凋亡的途徑，也可以磷酸化beclin1，減少beclin1和bcl-XL結合，從而誘導自噬反應。因此該基因是凋亡和自噬的關聯(lián)基因，Caspase-8也是細胞凋亡的重要啟動基因。近年來研究顯示，Caspase-8在細胞自噬中非常重要[8-9]。Yu等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-8不僅可以調節(jié)凋亡，還可以抑制自噬性細胞死亡。Caspase-8抑制劑可通過調節(jié)Beclin 1和Atg7來促進自噬，提示caspase-8在細胞凋亡和細胞自噬中可能起到開關的作用。本研究還分析了ARHI基因對自噬相關的17個基因表達譜的影響，結果顯示ARHI基因可以顯著上調TNFRSF10B等7個基因的表達，其中DAPK1表達上調42.83倍，caspase-8基因表達上調5.91倍，提示ARHI促進細胞凋亡和細胞自噬主要是通過caspase-8和DAPK1來調控兩個程序的執(zhí)行。

[1] Yang H,Lu X,Qian J,et al.Imprinted tumor suppressor gene ARHI induces apoptosis correlated with changes in DNA methylation in pancreatic cancer cells. Mol Med Rep,2010,3:581-587.

[2] Lu X, Qian J, Yu Y, et al.Expression of the tumor suppressor ARHI inhibits the growth of pancreatic cancer cells by inducing G1 cell cycle arrest. Oncol Rep,2009,22: 635-640.

[3] Fan YJ, Zong WX. The cellular decision between apoptosis and autophagy. Chin J Cancer,2013,32:121-129.

[4] Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon H-U, et al, Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Differ,2009, 16: 966-975.

[5] 周彩虹， 黃啟福.凋亡與腫瘤及其治療進展.中國病理生理雜志，2004,20:2124-2133.

[6] Rudin CM, Thompson CB. Apoptosis and disease:regulation and clinical relevance of programmed cell death. Annu Rev Med, 1997, 48:267-281.

[7] 焦俊霞,高維娟.細胞凋亡的信號轉導機制研究進展.中國老年學雜志，2010,30:853-856.

[8] Hou W,Han J, Lu C, et al. Autophagic degradation of active caspase-8,A crosstalk mechanism between autophagy and apoptosis. Autophagy,2010, 6: 891-900.

[9] Yu L, Alva A, Su H,et al. Regulation of an ATG7-beclin1 program of autophagic cell death by caspase-8. Science, 2004, 304: 1500-1502.

EffectofARHItransfectiononapoptosisandautophagyrelatedgeneexpressionprofileofPANC1cells

YANGHong,LUXin-qing,LIJi,ZHUYong-jian,DINGHui,WANGJian,HUYi-qun,DENGWei-ping,QIANJia-ming.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

ObjectiveTo investigate the effect of ARHI transfection on the apoptosis and autophagy related gene expression profile of PANC1 cells.MethodsPlasmids pIRES2-EGFP-ARHI which expressing ARHI and empty plasmid pIRES2-EGFP were transfected into PANC1 cells. Expression profile, including 84 apoptosis and autophagy related genes was detected by using quantitative real-time PCR based RT2Profiler TM PCR Array.ResultsIn PANC1 cells transfected with pIRES2-EGFP-ARHI, the expression of mRNA of 9 genes were down-regulated, and 38 were up-regulated, while 37 were not significantly changed. Among the apoptosis related genes, 8 pro-apoptotic genes were significantly up-regulated (>6 folds), and them mainly consisted TNFR/TRFSR family (TNFSF8, TNFRSF10B, TNFRSF11B, TNFRSF9), CIDE family (DFFA), CASP family (CASP10, CASP8), death domain gene family (DAPK1), and the increase of DAPK1 was the most significant (42.83 folds). Three anti-apoptotic genes (CD27, BCL2L10, BIRC4) were significantly up-regulated (>6 folds), and 3 genes (BCL2, BAD, BAG) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (BCL2L1) was slightly down-regulated (>2 folds). Among the autophagy related genes, 3 pro-autophagy genes were significantly up-regulated (>6 folds), 4 genes (TNFRSF10A, FADD, TP53, TP53BP2) were slightly up-regulated (>2 folds); 3 anti-autophagy genes (BCL2, CASP8, FAS) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (MCL1) was slightly down-regulated (>2 folds).ConclusionsARHI significantly up-regulates autophagy-related important regulatory genes Caspse8 and DAPK1.

Pancreatic neoplasms; Apoptosis; Autophagy; Gene expression; ARHI gene

2013-07-30)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.002

國家自然科學基金(81072055)；高等學校博士點專項科研基金(20101106120059)

100730 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院消化科

錢家鳴，Email：qjiaming1957@aliyun.com