曲笑瑩，高世勇

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076)

連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個過程為細(xì)胞周期.整個細(xì)胞周期可分為間期和有絲分裂期，M期即為有絲分裂期，是染色體真正開始分離時期.間期又可進(jìn)一步細(xì)分為G1期、S期、G2期三個時相.G1期為DNA合成前期，該期是從第一次細(xì)胞分裂完成到DNA復(fù)制開始之前的間隙時間.有些細(xì)胞進(jìn)入G1期后也可能出現(xiàn)暫不增殖的情況，這種不進(jìn)入周期的細(xì)胞被稱為G0期細(xì)胞.S期為DNA合成期，在該時相，組蛋白、非組蛋白及各種酶類進(jìn)行大量的合成.G2期為DNA合成后期，這一時期主要為細(xì)胞有絲分裂準(zhǔn)備物質(zhì)條件.

細(xì)胞分裂完成一個周期的時間稱為細(xì)胞的倍增時間，測定細(xì)胞倍增時間和各時期時長在研究細(xì)胞同步化、細(xì)胞動力學(xué)、藥物在體外作用的前期實驗等方面具有重要作用.

1 細(xì)胞周期測定應(yīng)用

1.1 同步化應(yīng)用

應(yīng)用CCK－8法測定細(xì)胞倍增時間，以確定細(xì)胞同步化試劑的給藥時長.取培養(yǎng)的JEC細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計數(shù)，接種于96孔板，分成6組.培養(yǎng)24 h后每隔2～4 h加入CCK－8，置于37℃、5%CO2恒溫孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度(A)值，直至A值升至基點(diǎn)時A值的2倍，得細(xì)胞倍增時間[1].在細(xì)胞同步化過程中測定細(xì)胞倍增時間可以提高對細(xì)胞同步的精確度，使細(xì)胞同步率達(dá)到更高的水平.

1.2 臨床應(yīng)用

S+G2+M期反映了細(xì)胞增殖狀態(tài)，在白血病治療前，患者骨髓細(xì)胞在S期和G2/M期比例減少[2－3]，G0/G1期比例升高，表明白血病細(xì)胞增值活性低于正常[4].在臨床上測定細(xì)胞群體的各時期分布和倍增時間，可以了解細(xì)胞DNA含量、細(xì)胞增殖等特性，對指導(dǎo)治療、判斷和預(yù)后有重要意義.

苑錦英等[5]對肝癌的細(xì)胞周期比例與名種常用化療藥物敏感性的關(guān)系進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期的改變與化療藥物的敏感性改變相關(guān).肝癌細(xì)胞周期比例與化療藥物抑制率之間有明顯關(guān)系，各種化療藥物對肝癌抑制率上的差異可以通過肝癌細(xì)胞周期比例上的不同需反映出來，對于提高腫瘤的化療效果具有重要的臨床指導(dǎo)意義.

1.3 藥代動力學(xué)應(yīng)用

在動物實驗中測定細(xì)胞倍增時間，有助于對動物細(xì)胞動力學(xué)方面的研究.高鳳鳴等[6]在對小鼠骨髓造血細(xì)胞動力學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對大鼠骨髓造血細(xì)胞細(xì)胞周期及其各有關(guān)時相的持續(xù)時間進(jìn)行了研究.

2 總倍增時間測定方法

2.1 生長曲線法

利用生長曲線法測定細(xì)胞倍增時間的方法，分為作圖法和公式法兩種[7]，都是通過細(xì)胞計數(shù)或者其他方法檢測每生長24 h的細(xì)胞總數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線圖.如圖1所示.

圖1 生長曲線

作圖法是從圖1中對數(shù)期任意兩截點(diǎn)所表示的細(xì)胞數(shù)和變化時間計算出細(xì)胞生長速率，從而得出倍增時間.

公式法是通過式(1)計算倍增時間.

其中:Td為倍增時間，Δt為計數(shù)間隔天數(shù)，Nt為對數(shù)生長期任一點(diǎn)的理論觀察值，N0為對數(shù)生長期理論初始值.但由于細(xì)胞計數(shù)存在誤差，使計算出的每天的倍增時間差異較大，不夠精確，目前多采用建立生長曲線的擬合曲線，并用倍增公式推導(dǎo)簡化來的公式(2)進(jìn)行計算，可得到較準(zhǔn)確地對數(shù)期倍增時間[8].

其中:Td為倍增時間，b1為式(1)簡化系數(shù).在實際操作中，細(xì)胞生長狀態(tài)會因外界環(huán)境發(fā)生一定改變，個人實驗操作手法不同導(dǎo)致細(xì)胞計數(shù)產(chǎn)生誤差，都會對結(jié)果產(chǎn)生影響，所以計數(shù)繪制生長曲線法只能大致計算出細(xì)胞的倍增時間，如果想要更精確的結(jié)果，還要通過其他方法進(jìn)行.

2.2 3 H－TdR脈沖標(biāo)記法

3H－TdR脈沖標(biāo)記DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂指數(shù)觀測法，是最經(jīng)典的測定細(xì)胞周期各時相時間的方法[9]，它是利用3H－TdR(胸腺嘧啶核苷)摻入DNA和放射自顯影計數(shù)，通過在體外采用3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷酸脈沖標(biāo)記，隨后，每個一定時間取樣做細(xì)胞放射自顯影，找出正處于有絲分裂的細(xì)胞，計算其中帶有3H標(biāo)記的細(xì)胞占有絲分裂細(xì)胞的百分比，繪制曲線，即可大致確定細(xì)胞倍增時間.此方法適用于細(xì)胞運(yùn)行時間短，周期運(yùn)轉(zhuǎn)均勻的細(xì)胞群體.

3H－TdR脈沖標(biāo)記法需要用到放射性同位素，對細(xì)胞周期有一定影響，且在細(xì)胞群類較為復(fù)雜時不適用.由于放射性同位素在實驗中易造成污染，所以此法目前使用較少.

2.3 BrdU摻入聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)法

通過測定S期細(xì)胞比例及S期持續(xù)時間，求得細(xì)胞倍增時間[10].在培養(yǎng)的細(xì)胞中摻入5－溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，可代替胸腺嘧啶摻入S期細(xì)胞)，在特定時間點(diǎn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測S期細(xì)胞比例，通過觀察S期細(xì)胞比例的增長趨勢和線性關(guān)系的改變，確定S期持續(xù)時間.認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)入和流出S期速率相同，則TS/S%=Tc(Tc為倍增時間).

由于流式細(xì)胞術(shù)操作簡便，結(jié)果相對準(zhǔn)確全面，目前應(yīng)用其測定細(xì)胞周期較多.

2.4 MTT法/CCK－8法

MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)，生成僅活細(xì)胞可產(chǎn)生的藍(lán)色結(jié)晶，在DMSO中溶解，利用酶標(biāo)儀測定OD值，反映出活細(xì)胞數(shù)目.接種孔板后，當(dāng)細(xì)胞生長到對數(shù)期，用MTT比色法測定起始OD值，24 h后取特定時間點(diǎn)檢測，當(dāng)OD值為起始OD值2倍時即為倍增時間.CCK－8法是MTT升級方法，所用試劑相比MTT更易操作，更穩(wěn)定，靈敏度更高.檢測方法與MTT法類似[1].

此類方法操作簡單，靈敏度高、經(jīng)濟(jì)，但可能由于如操作不熟練、DMSO細(xì)胞毒性、結(jié)晶易被洗去等原因，導(dǎo)致結(jié)果波動較大.

3 各時期測定方法

3.1 3 H－TdR標(biāo)記放射自顯影

通過測定有絲分裂百分比的變化可以推斷各個時相的長度，推斷如圖2所示[11].

圖2 放射自顯影法推斷周期

3.2 作圖法

應(yīng)用作圖法推斷各時相長度需要得到以下四個數(shù)據(jù)[12]:1)細(xì)胞倍增時間;2)有絲分裂指數(shù);3)S期細(xì)胞百分比;4)G2期持續(xù)時間.設(shè)定細(xì)胞進(jìn)入和流出各時期的速率相同，在第一象限中作任意與x軸和y軸相交的直線，得到以上數(shù)據(jù)后作圖，結(jié)果如圖3所示.

圖3 作圖法推斷周期

根據(jù)各時相對應(yīng)點(diǎn)找到對應(yīng)到x軸上的時間點(diǎn)，從而得出個時相時長.

3.3 S期時長測定

細(xì)胞培養(yǎng)中摻入BrdU分別于連續(xù)增長的時間點(diǎn)收集細(xì)胞經(jīng)處理后通過流式細(xì)胞術(shù)測定S期細(xì)胞含量[13]，作圖4.

圖4 S期時長測定

設(shè)定細(xì)胞流入和流出S期的速率相同，通過S期細(xì)胞增長所成直線的延長線與x軸相交，交點(diǎn)的絕對值即為S期的時長.

4 結(jié)語

細(xì)胞倍增時間和各時相時長的測定，作為一項基礎(chǔ)實驗，越來越被愈加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒烍w系所重視，并且隨著技術(shù)手段的不斷提高，更精確、簡便的方便被用于實驗中.

目前出現(xiàn)的方法中，如CCK－8法、MTT法、生長曲線法具有操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，但在操作過程中由于細(xì)胞丟失、計數(shù)等方面存在誤差，可能會對測定結(jié)果造成影響.3H－TdR脈沖標(biāo)記法由于容易出現(xiàn)污染，已逐漸淘汰，被BrdU摻入聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)法所取代.流式細(xì)胞術(shù)在近幾年的研究中使用逐漸增多，技術(shù)的革新使流式細(xì)胞儀的使用更加人性化，實驗過程操作簡便，系統(tǒng)簡單易懂，數(shù)據(jù)的后期處理更加靈活全面.BrdU摻入聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)法能夠在短時間內(nèi)精確地測定出細(xì)胞倍增時間，并通過其他條件，推斷出各個時相的時長，是目前比較常用的測定細(xì)胞周期的方法.在實驗室過程中，可依據(jù)實驗條件、實驗要求精確度來選擇細(xì)胞周期測定方法.

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