李鳳彩，李月凱

慢加急性肝功能衰竭是慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的以黃疸急劇加深、凝血功能障礙為特征的肝功能失代償［1］。IFN－γ是一個(gè)重要的免疫反應(yīng)調(diào)控因子，主要由活化的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。最近研究表明慢加急性肝功能衰竭患者IFN－γ水平升高，IFN－γ可引起肝臟炎癥，參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病過(guò)程［2］。

甲基化是表達(dá)遺傳的一種重要機(jī)制，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的介導(dǎo)下，以5－腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將胞嘧啶加上一個(gè)甲基變?yōu)?－甲基胞嘧啶的一種化學(xué)修飾過(guò)程，可導(dǎo)致基因的表達(dá)異常但DNA序列不發(fā)生改變［3］，異常甲基化會(huì)導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生。本研究通過(guò)測(cè)定慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，探討IFN－γ基因啟動(dòng)子甲基化與慢加急性肝功能衰竭病情嚴(yán)重指標(biāo)的關(guān)系，為慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病及預(yù)后提供新的思路。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 慢加急性肝功能衰竭患者20例。其中男17例，女3例;平均年齡(45.9±11.3)歲。診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》。排除標(biāo)準(zhǔn):①急性妊娠脂肪肝;②藥物性肝炎，酒精性肝炎(男性＞40g/d至少5年;女性＞20g/d至少5年);③懷疑免疫性肝病，肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)等代謝性肝病;④移植術(shù)后再感染乙肝導(dǎo)致重型肝炎者;⑤確有原發(fā)性肝癌病史;⑥有肝炎以外嚴(yán)重疾病史，包括嚴(yán)重的心臟、肺、腎臟、消化、神經(jīng)、精神疾病、免疫調(diào)節(jié)性疾病、代謝性疾病或惡性腫瘤等。

1．2 方法 甲基化特異性PCR(MSP)反應(yīng):取新鮮外周靜脈血5 ml，肝素抗凝(25 U/ml)，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PMBc)，按照德國(guó)QIAGEN公司的DNA提取試劑盒步驟提取DNA，按照上海杰美公司的DNA甲基化修飾試劑盒步驟進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化，運(yùn)用MSP擴(kuò)增，根據(jù)Methprimer軟件設(shè)計(jì)引物，序列如下:M引物:5’－AAGAGTTAATATTTTATTAGGGCGA －3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAATCCTTTAACGAT －3’(下游引物)，U引物:5’－TGAAGAGTTAATATTTTATTA GGGTGA－3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAA TCCTTTAACAAT－3’(下游引物)。引物由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 3 min，95℃變性45 s，52℃退火1 min，72℃引物延伸45 s，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取8μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣后，進(jìn)行電泳，條件為120 V，35 min。電泳結(jié)束后，在紫外線下觀察結(jié)果并用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間顯著性分析采用兩組獨(dú)立樣本資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 IFN－γ基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài) 在研究中，筆者用甲基化特異性PCR法(MSP)測(cè)定了慢加急性肝功能衰竭患者的甲基化程度，結(jié)果顯示:20例慢加急性肝功能衰竭患者，IFN－γ甲基化者12例，非甲基化者為8例。

2．2 IFN－γ基因啟動(dòng)子甲基化與病情嚴(yán)重指標(biāo)的關(guān)系 慢加急性肝功能衰竭的診斷需要滿足血清TBIL＞170μmol/L或每天上升速度＞17.1μmol/L，血漿凝血酶原活動(dòng)度(PTA)＜40%。終末期肝病模型(MELD)評(píng)分系統(tǒng)最早是由于決定肝臟移植器官分配的優(yōu)先權(quán)的需要而提出的，是判斷肝衰竭患者預(yù)后的評(píng)價(jià)體系。該系統(tǒng)是利用血清膽紅素(TBIL)、血肌酐(Cr)、凝血酶原時(shí)間的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)及原發(fā)病因作為參數(shù)進(jìn)行量化而得出分值。MELD評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝衰竭患者的預(yù)后和生存率有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究將TBIL、PTA、MELD評(píng)分作為評(píng)價(jià)ACLF患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)，分析兩組間TBIL、PTA、MELD評(píng)分，測(cè)得IFN－γ甲基化組TBIL水平明顯低于非甲基化組(P＜0.01)，見(jiàn)圖1。并測(cè)得IFN－γ甲基化組與非甲基化組比較PTA水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖2。再者，甲基化組MELD水平明顯低于非甲基化組(P ＜0.01)，見(jiàn)圖3。

圖1 兩組TBIL水平比較

圖2 兩組PTA水平比較

圖3 兩組MELD評(píng)分比較

3 討論

本研究所測(cè)得慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ甲基化程度不同，而且不同的IFN－γ甲基化伴有不同的慢加急性肝功能衰竭病情嚴(yán)重程度指標(biāo)TBIL水平、MELD評(píng)分的不同。

前人研究表明IFN－γ參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病。孫穎等［3］曾報(bào)道，慢加急性肝功能衰竭患者的肝臟組織的IFN－γ水平明顯升高。Ohta等［4］報(bào)道，在重型肝炎的發(fā)病機(jī)制中，抗原特異性Thl分泌的IFN－γ起重要作用。姜榮龍等［5］報(bào)道，在慢性肝炎患者的外周血中，Th2細(xì)胞占大多數(shù)，Th1細(xì)胞占少數(shù)，但隨著肝臟炎癥活動(dòng)的加劇，Th1細(xì)胞比例則明顯增加。當(dāng)Th1細(xì)胞亞群占優(yōu)勢(shì)時(shí)，其分泌的細(xì)胞因子IFN－γ可通過(guò)直接或間接的作用增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性，特別是CD8+細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，加重肝臟的炎癥損傷［6］。

Melvin等［7］分析了T細(xì)胞系 IFN－γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)和其表達(dá)的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，IFN－γ基因啟動(dòng)子甲基化程度高時(shí)，IFN－γ基因低表達(dá)，反之，IFN－γ基因啟動(dòng)子甲基化程度低時(shí)，IFN－γ基因高表達(dá)，即IFN－γ基因表達(dá)水平和甲基化程度之間存在明顯負(fù)相關(guān)。Yano等［8］研究了Th1和Th2細(xì)胞的IFN－γ基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)后也得出了相似的結(jié)論，Th1的基因啟動(dòng)子是低甲基化的，Th1細(xì)胞可產(chǎn)生IFN－γ，而Th2的基因啟動(dòng)子是高甲基化的，Th2細(xì)胞不可產(chǎn)生IFN－γ，為了進(jìn)一步證實(shí)甲基化對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，Yano用5’－氮胞苷處理Th2細(xì)胞，以抑制組蛋白去乙?；刚心嫉交騿?dòng)子區(qū)而抑制甲基化形成，從而導(dǎo)致Th2細(xì)胞IFN－γ基因啟動(dòng)子去甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的Th2細(xì)胞能夠分泌IFN－γ。

綜上所述，IFN－γ啟動(dòng)子甲基化通過(guò)影響IFN－γ水平參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病并影響其嚴(yán)重程度。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)肝衰竭及人工肝學(xué)組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)重型肝病與人工肝學(xué)組．肝衰竭診療指南［J］．中華肝臟病雜志，2006，14(9):643 －646．

［2］孫 穎，李保森，徐東平，等．肝內(nèi)IFN－γ及其分泌細(xì)胞在乙型慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用［J］．傳染病信息，2008，21(4):227－230．

［3］Wolffe AP．Epigenetics:regulation through repression［J］．Science，1999，286(4):481 －486．

［4］Ohta A，Sekimoto M，Sato M，et al．Indispensable role of TNF － alpha and IFN－gamma at the effector phase of liver injury mediated by Th1 cells specific to hepatitis B virus surface antigen［J］．J Immunol，2000，165(2):956 － 961．

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