李鳳彩，李月凱

慢加急性肝功能衰竭是慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的以黃疸急劇加深、凝血功能障礙為特征的肝功能失代償［1］。IFN－γ是一個重要的免疫反應調(diào)控因子，主要由活化的Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生。最近研究表明慢加急性肝功能衰竭患者IFN－γ水平升高，IFN－γ可引起肝臟炎癥，參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病過程［2］。

甲基化是表達遺傳的一種重要機制，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的介導下，以5－腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將胞嘧啶加上一個甲基變?yōu)?－甲基胞嘧啶的一種化學修飾過程，可導致基因的表達異常但DNA序列不發(fā)生改變［3］，異常甲基化會導致很多疾病的發(fā)生。本研究通過測定慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討IFN－γ基因啟動子甲基化與慢加急性肝功能衰竭病情嚴重指標的關(guān)系，為慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病及預后提供新的思路。

1 資料與方法

1．1 研究對象 慢加急性肝功能衰竭患者20例。其中男17例，女3例;平均年齡(45.9±11.3)歲。診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》。排除標準:①急性妊娠脂肪肝;②藥物性肝炎，酒精性肝炎(男性＞40g/d至少5年;女性＞20g/d至少5年);③懷疑免疫性肝病，肝豆狀核變性(Wilson病)等代謝性肝病;④移植術(shù)后再感染乙肝導致重型肝炎者;⑤確有原發(fā)性肝癌病史;⑥有肝炎以外嚴重疾病史，包括嚴重的心臟、肺、腎臟、消化、神經(jīng)、精神疾病、免疫調(diào)節(jié)性疾病、代謝性疾病或惡性腫瘤等。

1．2 方法 甲基化特異性PCR(MSP)反應:取新鮮外周靜脈血5 ml，肝素抗凝(25 U/ml)，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PMBc)，按照德國QIAGEN公司的DNA提取試劑盒步驟提取DNA，按照上海杰美公司的DNA甲基化修飾試劑盒步驟進行DNA轉(zhuǎn)化，運用MSP擴增，根據(jù)Methprimer軟件設計引物，序列如下:M引物:5’－AAGAGTTAATATTTTATTAGGGCGA －3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAATCCTTTAACGAT －3’(下游引物)，U引物:5’－TGAAGAGTTAATATTTTATTA GGGTGA－3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAA TCCTTTAACAAT－3’(下游引物)。引物由上海生物工程公司合成。PCR反應條件:預變性95℃ 3 min，95℃變性45 s，52℃退火1 min，72℃引物延伸45 s，共運行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取8μl PCR擴增產(chǎn)物加樣后，進行電泳，條件為120 V，35 min。電泳結(jié)束后，在紫外線下觀察結(jié)果并用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1．3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件包進行，結(jié)果用均數(shù)±標準差±s)表示，組間顯著性分析采用兩組獨立樣本資料的χ2檢驗，P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2．1 IFN－γ基因啟動子的甲基化狀態(tài) 在研究中，筆者用甲基化特異性PCR法(MSP)測定了慢加急性肝功能衰竭患者的甲基化程度，結(jié)果顯示:20例慢加急性肝功能衰竭患者，IFN－γ甲基化者12例，非甲基化者為8例。

2．2 IFN－γ基因啟動子甲基化與病情嚴重指標的關(guān)系 慢加急性肝功能衰竭的診斷需要滿足血清TBIL＞170μmol/L或每天上升速度＞17.1μmol/L，血漿凝血酶原活動度(PTA)＜40%。終末期肝病模型(MELD)評分系統(tǒng)最早是由于決定肝臟移植器官分配的優(yōu)先權(quán)的需要而提出的，是判斷肝衰竭患者預后的評價體系。該系統(tǒng)是利用血清膽紅素(TBIL)、血肌酐(Cr)、凝血酶原時間的國際標準化比值(INR)及原發(fā)病因作為參數(shù)進行量化而得出分值。MELD評分系統(tǒng)對肝衰竭患者的預后和生存率有良好的預測價值。本研究將TBIL、PTA、MELD評分作為評價ACLF患者病情嚴重程度的指標，分析兩組間TBIL、PTA、MELD評分，測得IFN－γ甲基化組TBIL水平明顯低于非甲基化組(P＜0.01)，見圖1。并測得IFN－γ甲基化組與非甲基化組比較PTA水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見圖2。再者，甲基化組MELD水平明顯低于非甲基化組(P ＜0.01)，見圖3。

圖1 兩組TBIL水平比較

圖2 兩組PTA水平比較

圖3 兩組MELD評分比較

3 討論

本研究所測得慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ甲基化程度不同，而且不同的IFN－γ甲基化伴有不同的慢加急性肝功能衰竭病情嚴重程度指標TBIL水平、MELD評分的不同。

前人研究表明IFN－γ參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病。孫穎等［3］曾報道，慢加急性肝功能衰竭患者的肝臟組織的IFN－γ水平明顯升高。Ohta等［4］報道，在重型肝炎的發(fā)病機制中，抗原特異性Thl分泌的IFN－γ起重要作用。姜榮龍等［5］報道，在慢性肝炎患者的外周血中，Th2細胞占大多數(shù)，Th1細胞占少數(shù)，但隨著肝臟炎癥活動的加劇，Th1細胞比例則明顯增加。當Th1細胞亞群占優(yōu)勢時，其分泌的細胞因子IFN－γ可通過直接或間接的作用增強NK細胞、巨噬細胞活性，特別是CD8+細胞活性，促進細胞免疫反應，加重肝臟的炎癥損傷［6］。

Melvin等［7］分析了T細胞系 IFN－γ基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)和其表達的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，IFN－γ基因啟動子甲基化程度高時，IFN－γ基因低表達，反之，IFN－γ基因啟動子甲基化程度低時，IFN－γ基因高表達，即IFN－γ基因表達水平和甲基化程度之間存在明顯負相關(guān)。Yano等［8］研究了Th1和Th2細胞的IFN－γ基因啟動子的甲基化狀態(tài)后也得出了相似的結(jié)論，Th1的基因啟動子是低甲基化的，Th1細胞可產(chǎn)生IFN－γ，而Th2的基因啟動子是高甲基化的，Th2細胞不可產(chǎn)生IFN－γ，為了進一步證實甲基化對于基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，Yano用5’－氮胞苷處理Th2細胞，以抑制組蛋白去乙?；刚心嫉交騿幼訁^(qū)而抑制甲基化形成，從而導致Th2細胞IFN－γ基因啟動子去甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后的Th2細胞能夠分泌IFN－γ。

綜上所述，IFN－γ啟動子甲基化通過影響IFN－γ水平參與慢加急性肝功能衰竭的發(fā)病并影響其嚴重程度。

［1］中華醫(yī)學會感染病分會肝衰竭及人工肝學組，中華醫(yī)學會肝病分會重型肝病與人工肝學組．肝衰竭診療指南［J］．中華肝臟病雜志，2006，14(9):643 －646．

［2］孫 穎，李保森，徐東平，等．肝內(nèi)IFN－γ及其分泌細胞在乙型慢加急性肝衰竭發(fā)病機制中的作用［J］．傳染病信息，2008，21(4):227－230．

［3］Wolffe AP．Epigenetics:regulation through repression［J］．Science，1999，286(4):481 －486．

［4］Ohta A，Sekimoto M，Sato M，et al．Indispensable role of TNF － alpha and IFN－gamma at the effector phase of liver injury mediated by Th1 cells specific to hepatitis B virus surface antigen［J］．J Immunol，2000，165(2):956 － 961．

［5］姜榮龍，盧橋生，駱抗先，等．慢性乙型病毒性感染者外周血T輔助細胞1、2型因子的表達［J］．中華傳染病雜志，2000，18(1):26－28．

［6］Milich DR，Chodel FS，Hughes JL，et al．The hepatitis B virus core and eantigens elicit different Th cell subsets:antigen structure affect Th cell phenotype［J］．JVirol，1997，71(20):2192 －2201．

［7］Melvin AJ，McGurn ME，Bort SJ，et al．Hypomethylation of the interferon－gamma gene correlates with its expression by primaryT－lineage cells［J］．Eur J Immunol，1995，25(4):426 －430．

［8］Yano S，Ghosh P，Kusaba H，et al．Effect of promoter methylationon the regulation of IFN－gamma gene during in vitro differentiation of human peripheral blood T cells into a Th2 population［J］．J Immunol，2003，171(24):2510 －2516．