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        HPLC法測(cè)定維A酸的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)

        2013-10-17 05:27:18蔡文娟王伯濤王濟(jì)奎

        蔡文娟 王伯濤 王濟(jì)奎

        1.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院,江蘇南京 211816;2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 211816

        維A酸又稱維甲酸、視黃酸[1-2],是維生素A的活性代謝中間產(chǎn)物[3]。維A酸為多烯酸結(jié)構(gòu)的化合物,在光的影響下,易發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng),迅速轉(zhuǎn)化為異維A酸[4-5]。維A酸可影響骨的生長(zhǎng)和上皮代謝,能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖分化和角質(zhì)溶解[6],亦起到抑制腫瘤、治療痤瘡和銀屑病等作用[7-8],目前已應(yīng)用于臨床,但關(guān)于維A酸的溶解度及油水分配系數(shù)的研究,國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道。本文建立HPLC法,模擬人體皮膚環(huán)境,在32℃下,pH為5.8時(shí)測(cè)定了平衡溶解度及油水分配系數(shù),為維A酸劑型的研究提供參考。

        1 儀器與試劑

        LC-10ATvp島津高效液相色譜儀;HW-2000色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);BT 125D電子分析天平;SK2510HP超聲波清洗器;THZ-22臺(tái)式恒溫振蕩器。

        維A酸原料藥(東北制藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):0311 203001);維A酸對(duì)照品(美國(guó)SIGMA公司,批號(hào):J1F266)。

        甲醇為色譜純;冰醋酸、正辛醇為分析純;水為去離子水。

        2 方法及結(jié)果

        2.1 溶液的制備

        2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取維A酸對(duì)照品12.5 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL,置50 mL棕色量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

        2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取維A酸供試品12.5 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為維A酸供試品儲(chǔ)備液。精密吸取供試品儲(chǔ)備液2 mL,置50 mL棕色量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

        2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

        2.2.1 流動(dòng)相的選擇 《英國(guó)藥典》“維A酸”流動(dòng)相條件為:甲醇-水-冰醋酸(770∶225∶5);《美國(guó)藥典》“維 A 酸”流動(dòng)相條件為:異辛烷-異丙醇-冰醋酸(99.65∶0.25∶0.1);《中國(guó)藥典》2010年版“維A酸”流動(dòng)相條件為:甲醇-2%冰醋酸溶液(81∶19)。 綜合 3 種條件,以《中國(guó)藥典》2010 年版“維 A酸”流動(dòng)相為起始條件,進(jìn)行試驗(yàn),并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化。結(jié)果見(jiàn)表1。

        2.2.2 色譜條件的確定 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.4)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為 355 nm;流速為 1.0 mL/min,柱溫為 40℃,進(jìn)樣量為 20 μL。

        在此色譜條件下,取適當(dāng)濃度的維A酸對(duì)照品及供試品溶液20 μL注入液相色譜儀,理論塔板數(shù)按維A酸峰計(jì)不低于9 000,維A酸保留時(shí)間為13.4 min,拖尾因子為1.01,其雜質(zhì)對(duì)主峰測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

        表1 流動(dòng)相的選擇

        2.3 線性關(guān)系考察

        稱取維A酸對(duì)照品20 mg,精密稱定,置于50 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻。分別精密吸取上述溶液 1、2、3、4、5 mL 置于 100 mL 棕色量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻。精密吸取上述溶液20 μL,注入液相色譜儀,以峰面積(A)對(duì)濃度(C)作線性回歸,考察線性關(guān)系,并求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=91 399X+18 088,r=0.999 8(n=5)。 結(jié)果表明,在 4.04~20.20 μg/mL的濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

        2.4 精密度試驗(yàn)

        按“2.1.2”項(xiàng)下配制6份濃度為10 μg/mL的維A酸供試品溶液,平行進(jìn)樣6次,計(jì)算6份溶液的RSD值。結(jié)果表明,6份樣品的RSD值為0.64%,說(shuō)明本方法精密度好。

        2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        按“2.1.2”項(xiàng)下配制低、中、高3個(gè)濃度的維A酸供試品,溶液濃度分別為 8、10、12 μg/mL。精密吸取供試品溶液,及“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中維A酸含量,并計(jì)算回收率。高、中、低3種濃度的準(zhǔn)確度均好。結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 回收率測(cè)定結(jié)果

        2.6 溶液穩(wěn)定性考察

        按“2.1”項(xiàng)下配制濃度為20 μg/mL的維A酸溶液及對(duì)照品溶液。分別于0、12、24 h時(shí)測(cè)定其含量,結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        表3 維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中的穩(wěn)定性

        2.7 平衡溶解度的測(cè)定

        2.7.1 水中的溶解度 稱取維A酸20 mg,置具塞三角瓶中,加水500 mL,于恒溫振蕩器32℃下振搖24 h,靜置12 h,分取上清液200 mL于分液漏斗中,加入1 mL二氯甲烷萃取,重復(fù)萃取兩次。下層液置于2 mL容量瓶中。精密吸取供試品和對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀,記錄峰面積。由外標(biāo)法計(jì)算維A酸在水中的溶解度。經(jīng)計(jì)算得維A酸在水中的溶解度小于0.1 mg/mL。

        《中國(guó)藥典》2010年版二部“維A酸”正文中對(duì)其溶解度的描述為:“在水中幾乎不溶”,“幾乎不溶”系指溶質(zhì)1 g(mL)在溶劑10 000 mL中不能完全溶解,本試驗(yàn)所測(cè)結(jié)果與其描述一致。

        2.7.2 正辛醇中的溶解度 稱取維A酸50 mg置棕色量瓶中,加正辛醇10 mL溶解,32℃振搖24 h,靜置觀察,若維A酸完全溶解,則繼續(xù)加維A酸,每次50 mg,32℃振搖24 h至溶液達(dá)到飽和,恒溫靜置12 h,精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶,加甲醇稀釋至刻度,搖勻;再精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。經(jīng)外標(biāo)法計(jì)算得維A酸在正辛醇中的溶解度為6.25 mg/mL。

        2.8 表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

        人體皮膚pH值為4.5~6.5,平均5.75,體表溫度32℃,為模擬人體環(huán)境,故選擇pH 5.8的磷酸鹽緩沖體系,并在32℃下進(jìn)行試驗(yàn)。

        2.8.1 水相的配制 按 《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅤD配制磷酸鹽緩沖液(pH=5.8)100 mL。油相為正辛醇溶液。

        2.8.2水飽和正辛醇溶液及正辛醇飽和水溶液的制備 分別量取60 mL油相和水相溶液置于分液漏斗中,32℃下振搖12 h,靜置過(guò)夜。上層為磷酸鹽飽和的正辛醇,下層為正辛醇飽和的磷酸鹽緩沖液。

        取維A酸12.5 mg,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加磷酸鹽飽和的正辛醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻。精密吸取該溶液15 mL,精密吸取正辛醇飽和的磷酸鹽溶液15 mL,置分液漏斗中,充分振搖,于32℃恒溫靜置至水相澄清。精密吸取上層油相2 mL至50 mL棕色量瓶中,以流動(dòng)相溶液稀釋至刻度,搖勻,作為油相供試品溶液。同時(shí),精密吸取下層正辛醇飽和的水溶液20 μL作為水相供試品溶液。

        精密稱取維A酸對(duì)照品12.5 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻。繼續(xù)精密吸取2 mL至50 mL棕色量瓶中,以流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。

        分別精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。由外標(biāo)法計(jì)算油相及水相中維A酸的濃度,分別記作C1,C2,按公式計(jì)算表觀油水分配系數(shù):Papp=C1/C2,lgP=lgC1/C2。其中,C1為藥物分配平衡時(shí),維 A酸在正辛醇中的濃度,C2為維A酸在水中的濃度。經(jīng)過(guò)外標(biāo)法計(jì)算得,表觀油水分配系數(shù)為36 079.8,lgP值為4.55。

        3 討論

        3.1 流動(dòng)相的選擇

        先通過(guò)調(diào)整甲醇和水的比例來(lái)選擇最佳保留時(shí)間。當(dāng)甲醇比例在81%~90%時(shí),提高甲醇比例能大幅縮短主峰的保留時(shí)間,但當(dāng)甲醇比例大于90%時(shí),主峰保留時(shí)間略有縮短,分離度降低,但過(guò)小的保留時(shí)間不利于主峰前雜質(zhì)完全分離。若保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),則造成分析效率降低、檢測(cè)成本增加。綜合考慮,選擇甲醇-水的比例為90∶10。

        再通過(guò)改變流動(dòng)相中冰醋酸比例來(lái)調(diào)整峰型。將表1編號(hào) 2、3、9,5、6,7、8 號(hào)列為三組,比較同組的試驗(yàn)結(jié)果,可以看出,當(dāng)冰醋酸比例變大時(shí),可以縮短保留時(shí)間,主峰拖尾因子略微升高,但分離度降低,綜合考慮冰醋酸比例還是0.4最佳。

        因此,選擇最佳流動(dòng)相比例為:甲醇-水-冰醋酸(90∶10∶0.4)。

        3.2 油水分配系數(shù)的意義

        藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物的水溶性、脂溶性有關(guān),即和油水分配系數(shù)有關(guān)。藥物要有適當(dāng)?shù)闹苄?,才能透過(guò)生物膜[9],而水溶性有利于藥物在體液內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),達(dá)到作用部位與受體結(jié)合,從而產(chǎn)生藥效,所以藥物需要有適當(dāng)?shù)挠退峙湎禂?shù)。

        一般認(rèn)為油水分配系數(shù)對(duì)數(shù)的最佳值,lgP在-1~2[10]。在此范圍內(nèi),藥物最易透皮。測(cè)量出的lgP大于2,表明本品屬于強(qiáng)脂溶性藥物(lgP>4),不宜作透皮用,同時(shí),鑒于維A酸的毒副作用,筆者不建議本藥品透皮。因此,油水分配系數(shù)的測(cè)定對(duì)劑型的預(yù)測(cè)有一定的指導(dǎo)意義。

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