蔡文娟 王伯濤 王濟(jì)奎

1.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 211816

維A酸又稱維甲酸、視黃酸[1-2]，是維生素A的活性代謝中間產(chǎn)物[3]。維A酸為多烯酸結(jié)構(gòu)的化合物，在光的影響下，易發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，迅速轉(zhuǎn)化為異維A酸[4-5]。維A酸可影響骨的生長(zhǎng)和上皮代謝，能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖分化和角質(zhì)溶解[6]，亦起到抑制腫瘤、治療痤瘡和銀屑病等作用[7-8]，目前已應(yīng)用于臨床，但關(guān)于維A酸的溶解度及油水分配系數(shù)的研究，國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道。本文建立HPLC法，模擬人體皮膚環(huán)境，在32℃下，pH為5.8時(shí)測(cè)定了平衡溶解度及油水分配系數(shù)，為維A酸劑型的研究提供參考。

1 儀器與試劑

LC-10ATvp島津高效液相色譜儀；HW-2000色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；BT 125D電子分析天平；SK2510HP超聲波清洗器；THZ-22臺(tái)式恒溫振蕩器。

維A酸原料藥（東北制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：0311 203001）；維A酸對(duì)照品（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)：J1F266）。

甲醇為色譜純；冰醋酸、正辛醇為分析純；水為去離子水。

2 方法及結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取維A酸對(duì)照品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取維A酸供試品12.5 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸供試品儲(chǔ)備液。精密吸取供試品儲(chǔ)備液2 mL，置50 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.2.1 流動(dòng)相的選擇 《英國(guó)藥典》“維A酸”流動(dòng)相條件為：甲醇-水-冰醋酸（770∶225∶5）；《美國(guó)藥典》“維 A 酸”流動(dòng)相條件為：異辛烷-異丙醇-冰醋酸（99.65∶0.25∶0.1）；《中國(guó)藥典》2010年版“維A酸”流動(dòng)相條件為：甲醇-2%冰醋酸溶液（81∶19）。 綜合 3 種條件，以《中國(guó)藥典》2010 年版“維 A酸”流動(dòng)相為起始條件，進(jìn)行試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2 色譜條件的確定 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為 355 nm；流速為 1.0 mL/min，柱溫為 40℃，進(jìn)樣量為 20 μL。

在此色譜條件下，取適當(dāng)濃度的維A酸對(duì)照品及供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)按維A酸峰計(jì)不低于9 000，維A酸保留時(shí)間為13.4 min，拖尾因子為1.01，其雜質(zhì)對(duì)主峰測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相的選擇

2.3 線性關(guān)系考察

稱取維A酸對(duì)照品20 mg，精密稱定，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液 1、2、3、4、5 mL 置于 100 mL 棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積（A）對(duì)濃度（C）作線性回歸，考察線性關(guān)系，并求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=91 399X+18 088，r=0.999 8（n=5）。 結(jié)果表明，在 4.04～20.20 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

按“2.1.2”項(xiàng)下配制6份濃度為10 μg/mL的維A酸供試品溶液，平行進(jìn)樣6次，計(jì)算6份溶液的RSD值。結(jié)果表明，6份樣品的RSD值為0.64%，說(shuō)明本方法精密度好。

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按“2.1.2”項(xiàng)下配制低、中、高3個(gè)濃度的維A酸供試品，溶液濃度分別為 8、10、12 μg/mL。精密吸取供試品溶液，及“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中維A酸含量，并計(jì)算回收率。高、中、低3種濃度的準(zhǔn)確度均好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

2.6 溶液穩(wěn)定性考察

按“2.1”項(xiàng)下配制濃度為20 μg/mL的維A酸溶液及對(duì)照品溶液。分別于0、12、24 h時(shí)測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 維A酸在甲醇-水-冰醋酸溶液中的穩(wěn)定性

2.7 平衡溶解度的測(cè)定

2.7.1 水中的溶解度 稱取維A酸20 mg，置具塞三角瓶中，加水500 mL，于恒溫振蕩器32℃下振搖24 h，靜置12 h，分取上清液200 mL于分液漏斗中，加入1 mL二氯甲烷萃取，重復(fù)萃取兩次。下層液置于2 mL容量瓶中。精密吸取供試品和對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。由外標(biāo)法計(jì)算維A酸在水中的溶解度。經(jīng)計(jì)算得維A酸在水中的溶解度小于0.1 mg/mL。

《中國(guó)藥典》2010年版二部“維A酸”正文中對(duì)其溶解度的描述為：“在水中幾乎不溶”，“幾乎不溶”系指溶質(zhì)1 g（mL）在溶劑10 000 mL中不能完全溶解，本試驗(yàn)所測(cè)結(jié)果與其描述一致。

2.7.2 正辛醇中的溶解度 稱取維A酸50 mg置棕色量瓶中，加正辛醇10 mL溶解，32℃振搖24 h，靜置觀察，若維A酸完全溶解，則繼續(xù)加維A酸，每次50 mg，32℃振搖24 h至溶液達(dá)到飽和，恒溫靜置12 h，精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取2 mL置50 mL棕色量瓶，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。經(jīng)外標(biāo)法計(jì)算得維A酸在正辛醇中的溶解度為6.25 mg/mL。

2.8 表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定

人體皮膚pH值為4.5～6.5，平均5.75，體表溫度32℃，為模擬人體環(huán)境，故選擇pH 5.8的磷酸鹽緩沖體系，并在32℃下進(jìn)行試驗(yàn)。

2.8.1 水相的配制 按 《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩⅤD配制磷酸鹽緩沖液（pH=5.8）100 mL。油相為正辛醇溶液。

2.8.2水飽和正辛醇溶液及正辛醇飽和水溶液的制備 分別量取60 mL油相和水相溶液置于分液漏斗中，32℃下振搖12 h，靜置過(guò)夜。上層為磷酸鹽飽和的正辛醇，下層為正辛醇飽和的磷酸鹽緩沖液。

取維A酸12.5 mg，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加磷酸鹽飽和的正辛醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液15 mL，精密吸取正辛醇飽和的磷酸鹽溶液15 mL，置分液漏斗中，充分振搖，于32℃恒溫靜置至水相澄清。精密吸取上層油相2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，作為油相供試品溶液。同時(shí)，精密吸取下層正辛醇飽和的水溶液20 μL作為水相供試品溶液。

精密稱取維A酸對(duì)照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻。繼續(xù)精密吸取2 mL至50 mL棕色量瓶中，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

分別精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由外標(biāo)法計(jì)算油相及水相中維A酸的濃度，分別記作C1，C2，按公式計(jì)算表觀油水分配系數(shù)：Papp=C1/C2，lgP=lgC1/C2。其中，C1為藥物分配平衡時(shí)，維 A酸在正辛醇中的濃度，C2為維A酸在水中的濃度。經(jīng)過(guò)外標(biāo)法計(jì)算得，表觀油水分配系數(shù)為36 079.8，lgP值為4.55。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

先通過(guò)調(diào)整甲醇和水的比例來(lái)選擇最佳保留時(shí)間。當(dāng)甲醇比例在81%～90%時(shí)，提高甲醇比例能大幅縮短主峰的保留時(shí)間，但當(dāng)甲醇比例大于90%時(shí)，主峰保留時(shí)間略有縮短，分離度降低，但過(guò)小的保留時(shí)間不利于主峰前雜質(zhì)完全分離。若保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則造成分析效率降低、檢測(cè)成本增加。綜合考慮，選擇甲醇-水的比例為90∶10。

再通過(guò)改變流動(dòng)相中冰醋酸比例來(lái)調(diào)整峰型。將表1編號(hào) 2、3、9，5、6，7、8 號(hào)列為三組，比較同組的試驗(yàn)結(jié)果，可以看出，當(dāng)冰醋酸比例變大時(shí)，可以縮短保留時(shí)間，主峰拖尾因子略微升高，但分離度降低，綜合考慮冰醋酸比例還是0.4最佳。

因此，選擇最佳流動(dòng)相比例為：甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.4）。

3.2 油水分配系數(shù)的意義

藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物的水溶性、脂溶性有關(guān)，即和油水分配系數(shù)有關(guān)。藥物要有適當(dāng)?shù)闹苄?，才能透過(guò)生物膜[9]，而水溶性有利于藥物在體液內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)到作用部位與受體結(jié)合，從而產(chǎn)生藥效，所以藥物需要有適當(dāng)?shù)挠退峙湎禂?shù)。

一般認(rèn)為油水分配系數(shù)對(duì)數(shù)的最佳值，lgP在-1～2[10]。在此范圍內(nèi)，藥物最易透皮。測(cè)量出的lgP大于2，表明本品屬于強(qiáng)脂溶性藥物（lgP＞4），不宜作透皮用，同時(shí)，鑒于維A酸的毒副作用，筆者不建議本藥品透皮。因此，油水分配系數(shù)的測(cè)定對(duì)劑型的預(yù)測(cè)有一定的指導(dǎo)意義。

[1]張強(qiáng)，鄭繼海.實(shí)用臨床藥物手冊(cè)[M].鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2009:213-213.

[2]王春艷，劉文君.急性白血病對(duì)維A酸耐藥及其逆轉(zhuǎn)研究進(jìn)展[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26（3）：216-219.

[3]汪濤，鄧樹(shù)海.HPLC法測(cè)定維A酸在小鼠骨髓中的含量[J].中國(guó)新藥雜志，2010，19（16）：1474-1472.

[4]邵鳳.維A酸軟膏中抗氧劑的初步篩選[J].中國(guó)藥房，2001，12（12）：714-715.

[5]魏立明，宋霞，宋三孔，等.HPLC雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定復(fù)方維A酸軟膏中 2 主藥的含量[J].中國(guó)藥房，2012，23（8）：737-739.

[6]袁華，封宇飛.48例維A酸不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J].藥物流行病學(xué)雜志，2011，20（7）：368-370.

[7]唐露笑，陳宏輝.維甲酸類藥物在肝癌治療中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（3）：416-418.

[8]詹凌，陳德宇，李紅林.維甲酸類藥物治療痤瘡和銀屑病臨床療效觀察[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2011，9（22）：5-6.

[9]張銳，施旻，劉建群.HPLC法測(cè)定苜蓿素的表觀油水分配系數(shù)[J].藥物分析雜志，2011，31（9）：1815-1817.

[10]Alfred B，Donald J，Abraham.Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery[M].New York：Wiley-Interscience，2003：249.