張健民 張凡喜 黃曉龍 周玉峰

解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400020

非轉移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB）是從人低轉移性黑素瘤細胞中克隆得到的一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種不同組織細胞中表達，如胚胎神經(jīng)系統(tǒng)、破骨細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞等[1]。研究表明，GPNMB在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，且與腫瘤的遷移和浸潤能力呈正相關[2]。研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB在膠質瘤細胞中的表達量明顯高于正常膠質細胞[3-4]，且與患者的預后呈負相關性。但是，關于GPNMB對神經(jīng)膠質母細胞瘤生物學特性的研究尚未見報道。因此，本研究通過RNA干擾方法抑制人膠質母細胞瘤細胞系U251和SHG44中GPNMB的表達，探討其對細胞凋亡、增殖及侵襲能力的影響，為進一步探討GPNMB在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用奠定基礎，并為以此為靶分子的膠質瘤的免疫療法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質母細胞瘤細胞系U251購自美國ATCC公司；人膠質母細胞瘤SHG44購自中科院上海細胞所；新生牛血清和MTT購自華美生物工程有限公司；鼠抗人GPNMB單克隆抗體購自艾美捷科技有限公司；HRP標記的羊抗鼠二抗購自南京生興生物技術有限公司；轉染試劑LipofetamineTM 2000購自Invitrogen公司；Transwell膜購自Millipore公司；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自BD公司。

1.2 GPNMB-siRNA

根據(jù)已知的人GPNMB編碼區(qū)序列設計3對GPNMB-siRNA，其堿基序列如下，sense：5'-GGUCAGUAUUUCCAGAAAUUU-3'，anti-sense：5'-UUCCAGUCAUAAAGGUCUUUA-3'；sense：5'-CUGCCAGAUUAACAGAUAUUU-3'，antisense：5'-UUGACGGUCUAAUUGUCUAUA-3'；sense：5'-GGCUGGUUUAUCUGCUGAUUU-3'，antisense：5'-UUCCGACCAAAUAGACGACUA-3'，交由上海吉泰生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 GPNMB-siRNA轉染 制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質體復合物，實驗組加入GPNMB-siRNA混合物，同時設置空白對照組（control）和脂質體對照組（mock）。將人膠質母細胞瘤細胞系U251和SHG44分別以2×105個/孔接種于6孔板，待細胞生長至70%～80%時，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM 2000將GPNMB-siRNA轉染細胞。

1.3.2 Western blot檢測GPNMB的沉默效果 將培養(yǎng)的細胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450 μL細胞裂解液裂解細胞，SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結束后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按照常規(guī)的方法加入鼠抗人GPNMB單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠二抗，Western blot分析GPNMB的沉默效果。

1.3.3 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 按操作說明書進行凋亡實驗，具體操作為：收集各組細胞，用預冷的PBS洗滌3次，加入1 mL 1×Annexin V結合緩沖液，離心去上清，再加入200 μL結合緩沖液重懸細胞，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI（5 μg/mL），輕輕混勻，避光孵育 30 min，流式細胞儀檢測。

1.3.4 MTT法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)期生長的U251和SHG44細胞接種于96孔板，每孔200 μL，含2×104個細胞，加入GPNMB-siRNA培養(yǎng)48 h，設置空白對照組；每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；棄上清，加入150 μL二甲基亞砜，搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解；酶標儀上測定570 nm處OD值。

1.3.5 Transwell檢測細胞侵襲能力 將培養(yǎng)的人膠質母細胞瘤U251和SHG44細胞消化成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3次，將細胞懸液密度調整成2×105個/mL備用。預先將Matrigel（提前12 h）用無血清培養(yǎng)基DMEM稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h，使Matrigel凝固形成基質膜。Transwell下腔室加入700 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，小室內(nèi)接種200 μL無血清細胞懸液，培養(yǎng)18 h后取出Transwell膜，預冷的PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色5～10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計穿過Transwell膜的細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗及單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GPNMB基因敲除效果

提取轉染siRNA細胞總蛋白，Western blot結果證實，與空白對照組和脂質體對照組相比，GPNMB-siRNA轉染組中GPNMB的表達量明顯下降（P＜0.05）。siRNA轉染的U251細胞中GPNMB表達量僅為18.97%，SHG44細胞中GPNMB的表達量僅為25.68%，表明GPNMB-siRNA轉染能特異性沉默U251和SHG44細胞中GPNMB的表達（圖1）。

2.2 GPNMB-siRNA對U251和SHG44細胞凋亡的影響

轉染48 h后，Annexin V/PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結果顯示，與空白對照組相比，GPNMB基因沉默對U251（圖2A）和SHG44細胞的凋亡無顯著影響（圖2B），表明GPNMB不參與調控人膠質母細胞瘤U251和SHG44細胞的凋亡。

2.3 GPNMB-siRNA對U251和SHG44細胞增殖能力的影響

MTT法檢測細胞生長曲線，以培養(yǎng)時間為橫軸和平均OD值為縱軸繪制生長曲線（圖3）。結果顯示，與空白對照組相比，GPNMB-siRNA轉染后U251和SHG44細胞的生長速度明顯減緩，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明GPNMB沉默可顯著影響人膠質母細胞瘤U251和SHG44細胞的增殖能力。

2.4 GPNMB-siRNA對U251和SHG44細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗結果顯示，GPNMB-siRNA轉染的U251和SHG44細胞侵出小室的數(shù)目分別為（70.0±4.6）個和（43.0±6.6）個。與空白對照組相比，轉染組細胞的侵出小室數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明GPNMB的缺失可明顯抑制人膠質母細胞瘤細胞的侵襲能力（圖 4）。

3 討論

神經(jīng)膠質母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見的原發(fā)性腫瘤，約占腦瘤發(fā)病率的50%，是腦癌中死亡率最高和最常見的一種，具有生長速度快和侵襲力強等特性[5]。盡管近年來治療手段不斷進步，但較高的侵襲性使膠質瘤治療效果并不是很理想，一般發(fā)病后患者的平均壽命僅14個月[6]。隨著分子生物學及免疫學等的發(fā)展，許多與腫瘤生物學特性相關的分子顯示出良好的應用前景[7-8]。因此，對與腫瘤生物學功能相關分子的研究具有重大意義。

GPNMB是一種典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達于多種組織中，參與細胞多種生理功能，如細胞的分化、炎癥、組織重建及腫瘤發(fā)育等[3]。研究表明，正常人腦組織中GPNMB不表達或者少量表達，而腦瘤患者中GPNMB大量表達，是正常人的10倍以上[9]。此外，GPNMB在多種惡性腫瘤中均表達，膠質母細胞瘤患者活體檢測分析表明，GPNMB與患者的預后分析呈負相關性，提示GPNMB具有作為腫瘤前期診斷及預后分析指標的潛能[4]。但是，關于GPNMB在膠質母細胞瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用值得進一步探討。

本研究通過RNA干擾法探討了GPNMB對膠質母細胞瘤細胞系生物學特性的影響，結果證實，GPNMB缺失對U251及SHG44細胞凋亡無顯著影響，但細胞的增殖能力和侵襲能力被顯著抑制，表明GPNMB參與調控人膠質母細胞瘤細胞的增殖及侵襲，提示GPNMB在膠質母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。此外，由于GPNMB能夠抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖及侵襲，有望成為膠質母細胞瘤治療的潛在靶分子。雖然本研究證實了GPNMB在神經(jīng)膠質母細胞瘤中發(fā)揮著重要作用，但是確切的信號途徑尚不清楚，有待于進一步探討。

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