張健民 張凡喜 黃曉龍 周玉峰

解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400020

非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB）是從人低轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中克隆得到的一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多種不同組織細(xì)胞中表達(dá)，如胚胎神經(jīng)系統(tǒng)、破骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等[1]。研究表明，GPNMB在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的遷移和浸潤(rùn)能力呈正相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，GPNMB在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于正常膠質(zhì)細(xì)胞[3-4]，且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性。但是，關(guān)于GPNMB對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生物學(xué)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)RNA干擾方法抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和SHG44中GPNMB的表達(dá)，探討其對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖及侵襲能力的影響，為進(jìn)一步探討GPNMB在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)，并為以此為靶分子的膠質(zhì)瘤的免疫療法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤SHG44購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；新生牛血清和MTT購(gòu)自華美生物工程有限公司；鼠抗人GPNMB單克隆抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofetamineTM 2000購(gòu)自Invitrogen公司；Transwell膜購(gòu)自Millipore公司；AV/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司。

1.2 GPNMB-siRNA

根據(jù)已知的人GPNMB編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)3對(duì)GPNMB-siRNA，其堿基序列如下，sense：5'-GGUCAGUAUUUCCAGAAAUUU-3'，anti-sense：5'-UUCCAGUCAUAAAGGUCUUUA-3'；sense：5'-CUGCCAGAUUAACAGAUAUUU-3'，antisense：5'-UUGACGGUCUAAUUGUCUAUA-3'；sense：5'-GGCUGGUUUAUCUGCUGAUUU-3'，antisense：5'-UUCCGACCAAAUAGACGACUA-3'，交由上海吉泰生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染 制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組加入GPNMB-siRNA混合物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（control）和脂質(zhì)體對(duì)照組（mock）。將人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和SHG44分別以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，采用LipofetamineTM 2000將GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3.2 Western blot檢測(cè)GPNMB的沉默效果 將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450 μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按照常規(guī)的方法加入鼠抗人GPNMB單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，Western blot分析GPNMB的沉默效果。

1.3.3 Annexin V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)，具體操作為：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入1 mL 1×Annexin V結(jié)合緩沖液，離心去上清，再加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI（5 μg/mL），輕輕混勻，避光孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的U251和SHG44細(xì)胞接種于96孔板，每孔200 μL，含2×104個(gè)細(xì)胞，加入GPNMB-siRNA培養(yǎng)48 h，設(shè)置空白對(duì)照組；每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h；棄上清，加入150 μL二甲基亞砜，搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處OD值。

1.3.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將培養(yǎng)的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251和SHG44細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整成2×105個(gè)/mL備用。預(yù)先將Matrigel（提前12 h）用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿(mǎn)Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h，使Matrigel凝固形成基質(zhì)膜。Transwell下腔室加入700 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，小室內(nèi)接種200 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液，培養(yǎng)18 h后取出Transwell膜，預(yù)冷的PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5～10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)穿過(guò)Transwell膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPNMB基因敲除效果

提取轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞總蛋白，Western blot結(jié)果證實(shí)，與空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組相比，GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染組中GPNMB的表達(dá)量明顯下降（P＜0.05）。siRNA轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞中GPNMB表達(dá)量?jī)H為18.97%，SHG44細(xì)胞中GPNMB的表達(dá)量?jī)H為25.68%，表明GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染能特異性沉默U251和SHG44細(xì)胞中GPNMB的表達(dá)（圖1）。

2.2 GPNMB-siRNA對(duì)U251和SHG44細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，Annexin V/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，GPNMB基因沉默對(duì)U251（圖2A）和SHG44細(xì)胞的凋亡無(wú)顯著影響（圖2B），表明GPNMB不參與調(diào)控人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251和SHG44細(xì)胞的凋亡。

2.3 GPNMB-siRNA對(duì)U251和SHG44細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸和平均OD值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖3）。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染后U251和SHG44細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減緩，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GPNMB沉默可顯著影響人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251和SHG44細(xì)胞的增殖能力。

2.4 GPNMB-siRNA對(duì)U251和SHG44細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示，GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染的U251和SHG44細(xì)胞侵出小室的數(shù)目分別為（70.0±4.6）個(gè)和（43.0±6.6）個(gè)。與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的侵出小室數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明GPNMB的缺失可明顯抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲能力（圖 4）。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，約占腦瘤發(fā)病率的50%，是腦癌中死亡率最高和最常見(jiàn)的一種，具有生長(zhǎng)速度快和侵襲力強(qiáng)等特性[5]。盡管近年來(lái)治療手段不斷進(jìn)步，但較高的侵襲性使膠質(zhì)瘤治療效果并不是很理想，一般發(fā)病后患者的平均壽命僅14個(gè)月[6]。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)等的發(fā)展，許多與腫瘤生物學(xué)特性相關(guān)的分子顯示出良好的應(yīng)用前景[7-8]。因此，對(duì)與腫瘤生物學(xué)功能相關(guān)分子的研究具有重大意義。

GPNMB是一種典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達(dá)于多種組織中，參與細(xì)胞多種生理功能，如細(xì)胞的分化、炎癥、組織重建及腫瘤發(fā)育等[3]。研究表明，正常人腦組織中GPNMB不表達(dá)或者少量表達(dá)，而腦瘤患者中GPNMB大量表達(dá)，是正常人的10倍以上[9]。此外，GPNMB在多種惡性腫瘤中均表達(dá)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者活體檢測(cè)分析表明，GPNMB與患者的預(yù)后分析呈負(fù)相關(guān)性，提示GPNMB具有作為腫瘤前期診斷及預(yù)后分析指標(biāo)的潛能[4]。但是，關(guān)于GPNMB在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用值得進(jìn)一步探討。

本研究通過(guò)RNA干擾法探討了GPNMB對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響，結(jié)果證實(shí)，GPNMB缺失對(duì)U251及SHG44細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響，但細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力被顯著抑制，表明GPNMB參與調(diào)控人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，提示GPNMB在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。此外，由于GPNMB能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，有望成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛在靶分子。雖然本研究證實(shí)了GPNMB在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮著重要作用，但是確切的信號(hào)途徑尚不清楚，有待于進(jìn)一步探討。

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