盧春來(lái) 郭 晶 古 杰 葛 棣 丁建勇 林宗武

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032）

食管癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，2008年全世界范圍內(nèi)食管癌新發(fā)病例約為48萬(wàn)，因食管癌致死的患者約40萬(wàn)；包括中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家食管癌發(fā)病率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家，并且這些地區(qū)的食管癌病理類(lèi)型主要為鱗癌［1］。食管癌具有高侵襲性，且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，尤其表現(xiàn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。食管癌患者預(yù)后較差，雖然近30年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，食管癌患者5年生存率有所提高，但僅為17%［2］。因此研究食管癌侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制成為目前迫切需要解決的問(wèn)題。

CXCR4是一種趨化因子受體，研究表明，CXCR4在多種實(shí)體惡性腫瘤中高表達(dá)，與患者預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)CXCR4與其單一配體CXCL12結(jié)合，可以激活下游多條信號(hào)通路，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移［3］。本研究檢測(cè)食管鱗癌患者原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中腫瘤細(xì)胞CXCR4及CXCL12的表達(dá)情況，分析它們和患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

資料和方法

研究對(duì)象 收集2006年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科行根治性手術(shù)的154例胸段食管鱗形細(xì)胞患者的石蠟標(biāo)本（包括腫瘤及正常組織），同時(shí)收集45例患者腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織標(biāo)本。病理診斷由兩位病理學(xué)專(zhuān)家共同認(rèn)定，食管癌TNM分期參照AJCC（美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)）標(biāo)準(zhǔn)（第6版）。

病例一般情況 男性，119例，女性，35例；年齡，38～85歲，平均年齡62歲，其中＞60歲78例，≤60歲76例；按腫瘤分化程度分組：Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)114例，Ⅲ26例 ；按腫瘤浸潤(rùn)深度分組：黏膜層及黏膜下層（T1）12例，肌層（T2）41例，全層（T3）95例，侵犯周?chē)M織（T4）6例；按腫瘤大小分組：＜3 c m 69例，≥3 c m 85例；按區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組：N091例，N163例；按TNM分期分組：Ⅰ期10例，Ⅱa期77例，Ⅱb期13例，Ⅲ期54例。

免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至水，以3%的過(guò)氧化氫靜置10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS液沖洗，經(jīng)抗原微波修復(fù)后分別以CXCL12抗體（Cl one 79018，美國(guó) R＆D 公司，稀釋濃度1∶300）及CXCR4抗體（Clone 44716，美國(guó)R＆D 公司，稀釋濃度1∶250）4℃過(guò)夜，之后Envision二抗（丹麥DAKO公司）37℃孵育30 min，DAB顯色液，蘇木精復(fù)染、封片。以PBS緩沖液代替一抗，其他步驟不變，結(jié)果作為陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果的評(píng)價(jià) 所有病理切片由兩位不了解患者病情及研究?jī)?nèi)容的病理科醫(yī)師共同判斷。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)切片中腫瘤細(xì)胞數(shù)目染色百分比及染色強(qiáng)弱判斷CXCL12及CXCR4表達(dá)水平，給予相應(yīng)積分：無(wú)表達(dá)，計(jì)0分；染色百分比≤50%，不管染色強(qiáng)弱，均計(jì)1分；染色百分比＞50%，染色弱陽(yáng)性，計(jì)2分；染色百分比＞50%，染色強(qiáng)陽(yáng)性，計(jì)3分。0分和1分定義為低表達(dá)，2分和3分定義為高表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Stata 11．0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)各指標(biāo)和患者臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，兩組間和多組間比較分別采用 Wilcoxon、Kr uskal－Wallis秩和檢驗(yàn)。CXCL12和CXCR4表達(dá)水平相關(guān)性采用Spear man秩相關(guān)檢驗(yàn)。原發(fā)腫瘤組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性腫瘤組織之間CXCL12和CXCR4表達(dá)水平比較采用t檢驗(yàn)。

按照年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、腫瘤分化、術(shù)后化療以及CXCL12、CXCR4高低表達(dá)分組，分別對(duì)患者無(wú)瘤生存期及總生存期進(jìn)行生存分析（Kaplan－Meier法），兩組或多組生存率采用Log－rank檢驗(yàn)（單因素分析）。

以年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化、術(shù)后化療以及CXCL12、CXCR4表達(dá)作為協(xié)變量，分別對(duì)患者無(wú)瘤生存期（disease free survival，DFS）及 總 生 存 期 （overall sur vival，OS）進(jìn)行Cox回歸分析（多因素分析）。

P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CXCL12和CXCR4染色表達(dá)情況 CXCL12陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)（圖1 A、B）；CXCR4陽(yáng)性表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜（圖1 C、D），按上述評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，CXCL12及CXCR4高表達(dá)率分別為53．2%和65．6%。

圖1 CXCL12和CXCR4在食管癌原發(fā)腫瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)情況Fig 1 CXCL12 and CXCR4 expressions in the pri mary and metastatic tumors

相關(guān)性比較結(jié)果

CXCL12和CXCR4表達(dá)水平與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性分析 CXCL12表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及腫瘤細(xì)胞分化）無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。不同性別組的CXCR4表達(dá)水平有差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；CXCR4表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期關(guān)系密切，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，表1）。

表1 CXCR4和CXCL12表達(dá)水平與食管癌臨床病理特征的相關(guān)性分析Tab 1 Analysis of the associations bet ween CXCL12／CXCR4 expressions and clinicopathologic features （n）

原發(fā)腫瘤組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)的相關(guān)性分析 原發(fā)腫瘤組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)水平具有相關(guān)性（P＝0．014，r＝0．198）。

原發(fā)腫瘤組織和腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中CXCL12和CXCR4表達(dá)水平的比較 45例腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中，CXCR4表達(dá)評(píng)分均值明顯高于與其配對(duì)的原發(fā)腫瘤組織（2．03 vs．1．84），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；而CXCL12表達(dá)評(píng)分均值雖高于原發(fā)腫瘤組織（2．82 vs．1．93），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05，圖2）。

圖2 原發(fā)及轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中CXCL12和CXCR4免疫組化評(píng)分的比較Fig 2 The comparison of CXCL12 and CXCR4 scores bet ween pri mary and metastatic tumors

單因素分析 單因素分析（表2）發(fā)現(xiàn)，CXCL12高表達(dá)患者DFS及OS低于CXCL12低表達(dá)患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；CXCR4高表達(dá)患者DFS及OS明顯低于CXCR4低表達(dá)患者，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4聯(lián)合表達(dá)陽(yáng)性的患者，其DFS及OS明顯低于CXCL12和CXCR4聯(lián)合表達(dá)陰性的患者，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；CXCL12和CXCR4聯(lián)合表達(dá)陽(yáng)性的患者，其中位DFS低于CXCR4陽(yáng)性表達(dá)的患者（20個(gè)月vs．22個(gè)月）；年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度及TNM分期也與患者生存預(yù)后相關(guān)（P＜0．05）；而腫瘤大小及術(shù)后化療則與患者生存預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0．05）。另外，區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者DFS及OS明顯低于陰性患者，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，圖3）。

多因素分析 Cox回歸分析（表3）顯示，CXCR4高表達(dá)及區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者DFS和OS的獨(dú)立預(yù)后不良因素（P＜0．05）。而年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化，CXCL12高表達(dá)和術(shù)后化療并不是患者DFS及OS的獨(dú)立預(yù)后不良因素（P＞0．05）。

表2 食管癌患者預(yù)后的單因素分析Tab 2 Univariate analysis of patients′survival （n）

圖3 CXCL12和CXCR4表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系Fig 3 The associations bet ween CXCL12 and CXCR4 expressions and patients′prognosis

表3 食管癌患者預(yù)后的多因素分析Tab 3 Multivariate analysis of patients′survival

討 論

趨化因子系統(tǒng)指的是一些小分子前炎性因子及其受體，它們參與調(diào)節(jié)感染、炎癥以及組織修復(fù)相關(guān)的免疫反應(yīng)，并且可以在胚胎形成階段調(diào)控多種細(xì)胞的遷移。趨化因子受體CXCR4是由352個(gè)氨基酸構(gòu)成的視紫紅質(zhì)樣G蛋白偶聯(lián)受體?；|(zhì)衍生因 子 （str o ma－derived f actor 1，SDF－1），亦 稱(chēng)CXCL12，是由68個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子細(xì)胞因子，屬于CXC趨化因子家族，目前認(rèn)為CXCL12是CXCR4的唯一配體。CXCR4是腫瘤中表達(dá)最為普遍的細(xì)胞因子受體，其配體CXCL12則在肺、肝臟、骨髓及淋巴結(jié)等腫瘤易于轉(zhuǎn)移的器官中有高表達(dá)，由此促成了腫瘤的靶向轉(zhuǎn)移。目前，已在胰腺癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等研究中證實(shí)CXCL12／CXCR4信號(hào)軸在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起關(guān)鍵作用［6］。

關(guān)于CXCL12／CXCR4與食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，目前相關(guān)研究結(jié)果并不一致。日本學(xué)者的研究［7］表明，CXCL12和CXCR4在食管鱗形細(xì)胞癌組織中均為高表達(dá)，CXCL12與食管癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，CXCL12高表達(dá)的患者生存時(shí)間明顯低于CXCL12低表達(dá)患者（P＜0．01）；而CXCR4與患者臨床病理特征及預(yù)后并無(wú)相關(guān)性（P＞0．01）。然而，另一項(xiàng)中國(guó)學(xué)者的研究結(jié)果表明［8］，CXCR4與患者臨床病理特征及預(yù)后具有相關(guān)性（P＜0．01），盡管CXCL12高表達(dá)的患者5年生存率低于CXCL12低表達(dá)患者，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。本次研究，我們也得到了與中國(guó)學(xué)者相似的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了CXCL12和CXCR4在食管鱗癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后有一定的相關(guān)性。

為了更加深入的探討CXCL12和CXCR4在食管癌轉(zhuǎn)移中的作用，我們不僅檢測(cè)了原發(fā)食管癌組織中CXCL12和CXCR4的表達(dá)情況，而且還檢測(cè)了這兩個(gè)指標(biāo)在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CXCL12在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中表達(dá)強(qiáng)度略高于原發(fā)腫瘤組織（P＞0．05）；而轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中CXCR4免疫組化評(píng)分明顯高于原發(fā)腫瘤組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。和配對(duì)的原發(fā)腫瘤組織相比較，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中CXCR4幾乎均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這一現(xiàn)象也可以說(shuō)明CXCR4陽(yáng)性表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移，CXCR4在食管癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到非常重要的作用。

本次研究，我們還發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤組織中CXCL12和CXCR4均為高表達(dá)，兩者表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性（P＜0．01），而且CXCL12和CXCR4共同高表達(dá)的患者其中位生存期明顯低于于CXCL12和CXCR4共同低表達(dá)的患者（P＜0．01）。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)食管癌腫瘤組織中CXCR4與基質(zhì)金屬蛋白酶－9（matrix metalloproteinase－9，MMP－9）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)具有相關(guān)性［9］。因此，我們推測(cè)食管鱗癌細(xì)胞可能通過(guò)自分泌CXCL12和CXCR4，兩者結(jié)合，激活下游相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（例如MMP－9、VEGF）的表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。在一項(xiàng)關(guān)于卵巢癌的研究中，上述的推測(cè)已經(jīng)得到了驗(yàn)證，研究者在體外抑制卵巢癌細(xì)胞株中CXCL12及CXCR4的表達(dá)，可以顯著下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，例如MMP－9、u PA的表達(dá)水平［10］。

我們的研究?jī)H僅是發(fā)現(xiàn)了CXCL12和CXCR4與食管癌轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性，推測(cè)CXCL12／CXCR4信號(hào)軸在食管癌轉(zhuǎn)移中可能起到重要作用。但是，CXCL12／CXCR4信號(hào)軸在食管癌中所激活的具體下游信號(hào)通路及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子的深入探討則需要進(jìn)一步的體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

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