張紅梅 ，白云 ，2，魏賢斌 ，鄧馨 ，肖莉杰 ，費志宏 ，方淑梅 ，韓毅強 ，王北艷

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.大慶市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局標(biāo)準(zhǔn)化所；3.黑龍江省八五三農(nóng)場；4.中國科學(xué)院植物研究所；5.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院）

中國野生大豆遺傳資源數(shù)量多、類型豐富，受到世界大豆主產(chǎn)國高度重視。野生大豆具有極強的抗逆性和豐富的遺傳多樣性，為栽培大豆的親緣較近的野生種，它是大豆育種極為重要的種質(zhì)資源[1-2]。野生大豆資源研究開發(fā)利用，對拓寬栽培大豆的遺傳基礎(chǔ)，提高大豆育種水平具有重要價值。

大豆GmRNF12 基因?qū)儆阡\指蛋白家族基因，對高鹽、低溫、金屬脅迫具有較強的抗性[3]。但研究者對野生大豆的鋅指蛋白家族基因研究較少。利用RT-PCR 技術(shù)擴增野生大豆GsRNF12 基因，并對基因編碼的氨基酸進行序列比對分析，并構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體，為進一步研究該基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大豆材料由實驗室收集。pGM-T vector 購自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌DH5α由實驗室保存。

限制性內(nèi)切酶、LA Taq 酶、T4-DNA 連接酶、RNA 提取試劑（RNAiso Reagent）、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-）、引物 Oligo（dT）、2.5 mMdNTP、RNA 酶抑制劑、Protein Molecular Weight Marker（Low）、膠回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由北京全式金生物公司合成，測序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成

利用TRIzol 試劑盒提取野生大豆葉片的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。

1.2.2 PCR 擴增

野生大豆與栽培大豆親緣關(guān)系較近，因此根據(jù)GenBank 登錄的栽培大豆的RNF12 基因全長設(shè)計特異引物，并在上下游引物的5′、3′端分別加AgeⅠ和ECORⅠ酶切位點序列，引物序列為：

5′-ACCGGTatgacgagcgcttcggagc-3′；

5′-C CGGAATTCttagttaattacaactatac-3′

在 25 μL 的反應(yīng)體系中，dNTP 1 μL，上、下游引物各 1 μL ，模板 cDNA 1 μL，LA Taq 酶 0.5 μL，10 倍 buffer 2.5 μL（含 Mg2+），以 ddH2O 補至 25 μL。PCR 擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃延伸 1 min，36 cycles，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 目的片段克隆、測序分析

將 PCR 產(chǎn)物回收后，按 3∶1 比例與克體pMD18-T 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進行藍(lán)白斑篩選，經(jīng)PCR 及酶切鑒定含有陽性重組質(zhì)粒的菌株送上海生物工程公司測序。將測序結(jié)果經(jīng) BLAST 比對，采用NCBI 的ORFfinder 確定該基因的開放閱讀框，氨基酸多序列比對用DNAman 軟件完成。

1.2.4 野大豆GsRNF12 基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒 pMDGsRNF12 和pEGAD 分別用AgeⅠ和ECORⅠ雙酶切，回收目的片段和載體大片段，經(jīng)T4 DNA 連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5A 感受態(tài)細(xì)胞，在LB 培養(yǎng)基（含有10 μg ·mL-1的卡那霉素）上篩選重組子。挑取陽性克隆，經(jīng)PCR檢測和酶切鑒定驗證重組質(zhì)粒，命名為pEGADGsRNF12。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsRNF12 基因 cDNA 序列的擴增及pMD GsRNF12 重組質(zhì)粒PCR、酶切鑒定結(jié)果

根據(jù)大豆GmRNF12 基因ORF 序列設(shè)計特異引物，以野生大豆cDNA 為模板進行PCR 擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大約在720 bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖1），與克隆載體連接后，經(jīng)AgeⅠ和ECORⅠ雙酶切、PCR 鑒定后，與預(yù)期結(jié)果大小基本一致。測序結(jié)果表明，所得序列長度為723 bp，命名為 GsRNF12。

圖1 質(zhì)粒pMD-GsRNF12 的PCR 及酶切鑒定Fig.1 PCR amplication and restriction analysis of pMD-GsRNF12 plasmid

2.2 GsRNF12 基因生物信息學(xué)分析

圖2 GsRNF12 ORF 序列及其所編碼的氨基酸序列Fig.2 ORF nucleotide sequence and putative amino acid sequence of GsRNF12

野大豆基因GsRNF12 的cDNA 序列包含1 個完整的開放閱讀框（1～723 bp），對GsRNF12 基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進行分析，編碼239 個氨基酸中（圖2），預(yù)測其等電點為6.23，該蛋白理論分子量為26.807 kDa。利用NCBI 對氨基酸進行保守區(qū)域分析，GsRNF12 在178-220 氨基酸處有典型的C4HC3 結(jié)構(gòu)域，屬于C3HC4 鋅指蛋白家族，利用PSORT 軟件分析GsRNF12 蛋白存在細(xì)胞核中。利用DNAman 軟件對野大豆、栽培大豆、苜蓿的RNF12 氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸序列與大豆、苜蓿同源性>80%。

2.3 GsRNF12 基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

目的片段與表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化后，對篩選出的陽性克隆進行PCR 和AgeⅠ、ECORⅠ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到約730 的目的帶（圖3），結(jié)果表明該片段大小正確，說明目的片段插入的位置和方向正確，成功構(gòu)建出了植物表達(dá)載體pEGAD-GsRNF12。（圖 4）。

圖3 植物表達(dá)載體pEGAD-GsRNF12 酶切、PCR 切鑒定Fig.3 Identification of pEGAD-GsRNF12 plant express ion vector by PCR amplification and enzyme digestion

圖4 植物表達(dá)載體pEGAD-GsRNF12 的鑒定Fig.4 Identification of plant expression vector pEGAD-GsRNF12

3 討論

鋅指蛋白在真核生物基因組中十分豐富，根據(jù)半胱氨酸（C）和組氨酸（H）殘基的數(shù)目和位置，將鋅指結(jié)構(gòu)分為 C2C2、C2H2、C3 H 2C3、C3 HC4（RI NG finger）4 個亞類[5]。針對非生物逆境的脅迫，通過一系列逆境信號分子，植物形成了非常復(fù)雜而完善的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鋅指蛋白基因家族在此調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用[6]。許多研究表明，鋅指蛋白在調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)基因表達(dá)和抗逆性起關(guān)鍵作用。研究利用優(yōu)化的PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)，我們克隆到了野生大豆鋅指蛋白命名為GsRNF12 基因cDNA 全長，屬于C3HC4 型鋅指蛋白基因。構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體，為下一步研究該基因功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 張春寶，趙洪錕，李啟云.野生大豆-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）基因的克隆與序列分析［J］.大豆科學(xué)，2008，27（6）：915-920.

［2］ 王丹陽，吳銘.對黑龍江省野大豆保護與利用的研究［J］.林業(yè)勘察設(shè)計，2011（1）：85-86.

［3］ 張紅梅.鋁脅迫下大豆差異基因表達(dá)及GmRNF12、GmFDR3 基因功能分析［D］.長春：吉林大學(xué)，2011.

［4］ 韓毅強，張云超，張紅梅.NaCl 脅迫對大豆種子萌發(fā)及其生理變化的影響［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2011，23（4）：11-14.

［5］ 劉強，張貴友，陳受宜.植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用［J］.科學(xué)通報，2000，45（14）：1465-1474.

［6］ Mukhopadhyay A，Vij S，Tyagi A K.Overexpression of a znic finger protein gene from rice confers tolerance to cold，dehydration and salt stress in transgenic tobacco［J］.PNAS ，2004，101（16）：6309-6314.