張懷成，王風清，馬昱澍，魏東芝

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器國家重點實驗室 魯華生物技術(shù)研究所，上海200237）

自然界中存在著以膽固醇及其類似物和相關(guān)衍生物為代表的一大類化合物，即甾體化合物。這類化合物以環(huán)戊烷多氫菲為母核，攜帶不同修飾基團。由于其母核上不同位置的不同取代基，往往表現(xiàn)出顯著不同的生理活性[1］，對大腦的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持等生理機能的調(diào)控至關(guān)重要。甾體藥物主要是甾體激素類藥物以及甾體型抗生素，如膽酸、雌二醇、雄酮、煙曲霉酸、夫西地酸等[2］。

甾體藥物的合成，目前較成熟的商業(yè)應(yīng)用工藝是利用薯蕷皂素（Diosgenin）經(jīng)化學(xué)修飾成16－醋酸雙烯醇酮后進一步合成得到，但該工藝存在成本高、步驟多、收率低、經(jīng)濟性差、環(huán)境友好度低、土地資源和自然資源浪費大等不足[3］。相較而言，甾體藥物的半合成制備，即利用天然甾體作為骨架進行結(jié)構(gòu)改造更具優(yōu)勢。其中以甾醇為原料、利用分枝桿菌等微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)甾體醫(yī)藥中間體9α－羥基雄甾烯酮（9α－OHAD），是目前甾體醫(yī)藥工業(yè)體系的一條重要工藝路線。然而甾醇水溶性差、傳質(zhì)效率低、底物毒害、產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)物降解等問題均制約著微生物菌株轉(zhuǎn)化能力的提高，也是影響該工藝推廣應(yīng)用的重要瓶頸[3］。

甾醇為非極性化合物，在水中的溶解度極低，僅約1μmol·L－1左右，且甾醇在水相中的傳質(zhì)效率很低，其生物可利用度不高，嚴重制約了分枝桿菌對甾醇底物的攝取利用效率[4］。研究表明，環(huán)糊精、硅油、聚丙二醇（PPG）、聚乙二醇（PEG）、離子溶液（Ionic liquids）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）、有機試劑（如甲醇、乙醇、丙酮）等均能有效促進微生物對甾醇的轉(zhuǎn)化，可顯著提高目標產(chǎn)物的積累量[5，6］。目前，PEG、PPG、硅油作為甾醇轉(zhuǎn)化促進劑的相關(guān)研究備受關(guān)注[5，7，8］，但研究多局限于對有機溶劑、離子溶液、硅油等大類別的探究，而系統(tǒng)的、細致的應(yīng)用性研究很少?；诖?，作者在此就PEG200、PPG2000和多種硅油對分枝桿菌HK86轉(zhuǎn)化甾醇產(chǎn)9α－OHAD的促進效果進行了比較分析，以期篩選到優(yōu)良的甾醇轉(zhuǎn)化促進劑。

1 實驗

1.1 菌株

新金分枝桿菌 HK86（Mycobacterium neoaurum HK86），自行保存。

1.2 培養(yǎng)基及各類配制溶液

種子培養(yǎng)基（MYC／01）：檸檬酸2g·L－1，甘油20g·L－1，K2HPO40.5g·L－1，檸檬酸鐵銨0.05g·L－1，MgSO4·7H2O 0.5g·L－1，NH4NO32g·L－1，加1L去離子水，用NaOH溶液調(diào)pH值至8.0。

種子固體培養(yǎng)基（MYC／01S）：以種子培養(yǎng)基（MYC／01）為基礎(chǔ)，添加1%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基（MYC／02）：葡萄糖10g·L－1，檸檬酸2g·L－1，K2HPO40.5g·L－1，檸檬酸鐵銨0.05g·L－1，MgSO4·7H2O 0.5g·L－1，（NH4）2HPO43.5g·L－1，加1L去離子水，用NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，添加設(shè)計濃度的甾醇。

甾醇母液（200g·L－1）：20g植物甾醇，添加5g吐溫－80，加熱溶解并定容至100mL，700W下超聲99次（每次超聲5s、間隔5s），4℃保存。

卡那霉素（Kanamycin）溶液：稱取1g卡那霉素溶解于10mL水中，將其配制成100mg·mL－1的母液，用0.22μm過濾器過濾除菌，而后按每管1mL分裝成小份，－20℃保存?zhèn)溆?。工作液濃度為母液稀?000倍，即50μg·mL－1。

1.3 菌種保藏

菌株培養(yǎng)至OD600為2～3，甘油終濃度20%，于－40℃凍存。

1.4 方法

1.4.1 菌體的培養(yǎng)與甾醇轉(zhuǎn)化

在MYC／01S上涂布活化分枝桿菌HK86，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至裝有MYC／01的5mL試管中進行種子一級活化，加入抗性（50μg·mL－1卡那霉素），培養(yǎng)5d左右至菌體呈亮黃色；而后以7%接種量將一級活化種子液轉(zhuǎn)接到裝有 MYC／01的搖瓶中（30mL／250 mL）進行二級活化，抗性添加同上，于30℃、200r·min－1培養(yǎng)活化3～4d至菌體呈淡黃色；再將二級活化種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有MYC／02的搖瓶中（30mL／250mL，底物濃度為10g·L－1），并以擬定添加方式和添加量加入甾醇轉(zhuǎn)化促進劑，于30℃、200r·min－1培養(yǎng)7d。最后萃取產(chǎn)物，進行定性和定量分析，評價各實驗組菌株對底物的轉(zhuǎn)化能力，并將其與對照組（加入等量的無菌水）相比較。

1.4.2 底物甾醇與產(chǎn)物9α－OHAD的分析

1.4.2.1 樣品制備

將發(fā)酵轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯以1∶1萃取2次，合并萃取液，減壓干燥后備用。

1.4.2.2 薄層層析（TLC）分析

實驗準備：層析液流動相為石油醚－乙酸乙酯（6∶4，體積比）；層析硅膠G／L板規(guī)格為5cm×10cm，于點樣端后0.5cm處鉛筆均勻標記以便進行結(jié)果的橫向分析，而后將其于100℃烘烤10min，備用；展層劑先加至層析缸中飽和30min左右；樣品用乙酸乙酯萃取或復(fù)溶。

樣品點板層析：用10μL移液槍分別吸取樣品10μL于各鉛筆標記處點樣，點樣間距約0.5～1cm；點樣方式：多次少量，盡量縮小點樣面積。

層析：將層析液倒入層析缸進行飽和，然后將點樣后的TLC薄板斜置于層析缸內(nèi)，待展層劑擴散至薄板上端后，取出薄板，用吹風機吹干，置于254nm紫外下觀察斑點，并初步判斷轉(zhuǎn)化水平。

顯色：將上一步驟處理后的TLC薄板用20%稀硫酸均勻噴淋，用干紙巾擦拭薄板背面殘液，之后將其置于110℃烘箱內(nèi)烘烤15min左右，使底物和各組分產(chǎn)物、副產(chǎn)物充分顯色，并進行定性分析。

1.4.2.3 高效液相色譜（HPLC）分析

樣品處理：轉(zhuǎn)化發(fā)酵液用乙酸乙酯以1∶1萃取，12 000r·min－1離心3min；取100μL含有產(chǎn)物的上清液置于潔凈的1.5mL EP管中，置于通風櫥中至乙酸乙酯揮發(fā)殆盡；而后加入10倍（1000μL）色譜級甲醇復(fù)溶（即將樣品稀釋10倍進行檢測）。

檢測參數(shù)：Agilent 1100型高效液相色譜儀；DAD紫外檢測器，波長254nm；柱溫40℃；進樣量5μL；流速1mL·min－1；流動相為甲醇∶水（7∶3，體積比）；Agilent XDB－C18色譜柱（4.6mm×250mm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 甾醇轉(zhuǎn)化促進效果比較

選擇PEG200、PPG2000和二甲基硅油作為甾醇轉(zhuǎn)化促進劑，在發(fā)酵培養(yǎng)48h時添加，添加濃度均為5%，考察不同轉(zhuǎn)化促進劑對甾醇轉(zhuǎn)化的促進作用，結(jié)果見圖1。

圖1 PEG200、PPG2000和二甲基硅油對甾醇轉(zhuǎn)化的促進作用Fig.1 Promotion effect of PEG200，PPG2000and dimethyl silicone oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖1可知，PEG200、PPG2000和二甲基硅油的加入均能在一定程度上促進菌株對底物甾醇的轉(zhuǎn)化能力，產(chǎn)物9α－OHAD的積累量分別提高了50%、85%和95%，其中二甲基硅油的促進效果最顯著。因此，后續(xù)研究進一步考察多種硅油對甾醇轉(zhuǎn)化的促進效果。

2.2 甾醇轉(zhuǎn)化促進劑的篩選

基于硅油對微生物轉(zhuǎn)化甾醇具有顯著促進作用，對7種不同規(guī)格的硅油進行了更為系統(tǒng)、細致的分析，不同硅油對甾醇轉(zhuǎn)化的影響見圖2。

圖2 不同硅油對甾醇轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of different silicone oils on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖2可知，苯甲基硅油、苯基硅油、二甲基硅油和聚醚改性硅油對甾醇的轉(zhuǎn)化均有不同程度的促進作用，尤其是聚醚改性硅油，產(chǎn)物積累量提高了近300%；而烷基硅油、氨基硅油和2420硅油則相反，對甾醇轉(zhuǎn)化有比較明顯的抑制作用，其中2420硅油對甾醇轉(zhuǎn)化的抑制最為嚴重。這表明并非所有硅油都會對甾醇的轉(zhuǎn)化起促進作用，這一點在相關(guān)文獻[5，7，8］中未指明。

隨后考察了硅油添加量對甾醇轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 硅油添加量對甾醇轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of addition amount of silicon oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖3可知：總體上，具有正面促進作用的硅油，其添加30%的效果略好于添加1%和5%時的效果，但對于聚醚改性硅油來講，添加5%的效果卻要優(yōu)于添加30%的效果，轉(zhuǎn)化率高出20%左右。經(jīng)過對各規(guī)格硅油的1%、5%和30%三個不同添加量的轉(zhuǎn)化分析比較，更加確認了聚醚改性硅油在微生物甾醇轉(zhuǎn)化上的突出表現(xiàn)，排除了由于促進劑非最優(yōu)濃度導(dǎo)致促進效果有限而造成的對最佳促進劑選擇的干擾。同時，由圖3還可知聚醚改性硅油擁有較低的最佳添加濃度，更有生產(chǎn)應(yīng)用價值。綜上所述，選擇聚醚改性硅油為最佳甾醇轉(zhuǎn)化促進劑。

2.3 聚醚改性硅油添加量和添加方式的優(yōu)化

進一步考察聚醚改性硅油添加量對甾醇轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 聚醚改性硅油添加量對甾醇轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of addition amount of polyether－modified silicone oil on the transformation of sterol to 9α－OHAD

由圖4可知，聚醚改性硅油在底物甾醇投料量為10g·L－1的條件下，最佳添加量為15%。

進一步對聚醚改性硅油的添加方式進行考察發(fā)現(xiàn)：聚醚改性硅油在第0d添加（即與菌種轉(zhuǎn)接同時直接添加）、第1d添加和第2d添加的實驗結(jié)果差別不大，沒有顯著的優(yōu)劣之分。同時，聚醚改性硅油在115℃下保持30min后，其對甾醇轉(zhuǎn)化的促進作用也未出現(xiàn)顯著差別，這表明聚醚改性硅油具有一定的耐高溫特性。鑒于此，為了操作方便，同時避免添加聚醚改性硅油時可能產(chǎn)生的不必要染菌，選擇在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時同時加入聚醚改性硅油和甾醇，滅菌后使用。

3 結(jié)論

PEG200、PPG2000和二甲基硅油的加入均能在一定程度上促進分枝桿菌HK86對底物甾醇的轉(zhuǎn)化能力，提高產(chǎn)物9α－OHAD的積累量。最終篩選到的最佳甾醇轉(zhuǎn)化促進劑是聚醚改性硅油，其最佳添加方式是在發(fā)酵起始時與甾醇同時添加，10g·L－1的甾醇投料量下的最佳添加量為15%。

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