劉 靜，戴 夢，章 麗，趙 穎，鄭桂珍，張 佳，王富強

（華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊050015）

環(huán)孢菌素 A[1］（Cyclosporin A，CyA）作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植，不同生物活性的CyA衍生物，具有抗真菌、抗炎、抗寄生蟲、抗 HIV等功能[2］。

作者前期分離得到一株稀有放線菌CYA4OH，經16SrDNA鑒定，屬于野野村菌（Nonomuraeasp.），該菌可以在CyA底物的4－位引入羥基，得到4－羥基CyA 衍生物[γHyMeLeu4］CyA。[γHyMeLeu4］CyA自身缺乏免疫抑制活性[3］，但具有潛在的抗真菌活性，還可以作為中間體進一步合成多種具有活性的藥物。

pZMW質粒[4］含有PermE啟動子和病毒φC31的整合位點（attP），可以通過接合轉移將外源基因轉入到糖多孢紅霉菌染色體中。野野村菌與糖多孢紅霉菌同屬放線菌類，作者在此構建了以硫鏈絲菌素抗性基因tsr為報告基因的表達載體pZMW－tsr，將其轉入大腸桿菌（Escherichia coli）ET12567（pUZ8002），采用接合轉移法將tsr基因轉入 [γHyMeLeu4］CyA 生 產 菌CYA4OH，嘗試在CYA4OH菌中表達外源基因，為其轉化機制及基因工程改造研究提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、質粒與培養(yǎng)基

本研究所用菌種均為自行保存。CYA4OH為[γHyMeLeu4］CyA生產菌，大腸桿菌DH5α為常規(guī)克隆和分子操作的宿主菌，大腸桿菌ET12567（pUZ8002）為接合轉移供體菌。

克隆載體pGEM－T購自Promega公司；表達載體pZM[5］、pZMW[4］為張部昌博士惠贈。

MS培養(yǎng)基：甘露醇2%，黃豆餅粉2%，瓊脂1.5%。

ISP2斜面培養(yǎng)基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.5%，pH 值7.3。

種子培養(yǎng)基：淀粉1.0%，葡萄糖0.7%，麥芽粉0.5%，酵母提取物0.45%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣0.005%，pH 值7.0。

2×YT培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.6%，酵母抽提物1%，NaCl 0.5%，pH 值7.0。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑、DNA Marker、膠回收試劑盒、連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.0，Takara公司；瓊脂糖、限制性內切酶，Promega公司；各種抗生素，Sigma公司；Easy－DNA試劑盒，Invitrogen公司；其它試劑均為國產分析純。引物由生工生物工程股份有限公司（Sangon）合成。

C24KC型搖床，New Brunswich Scientific公司；Allegra 64R 型離心機，Beckman公司；ABI9600型PCR儀，PE公司；電泳儀，北京六一儀器廠；LAS3000型成像儀，F(xiàn)UJIFILM公司。

1.3 pZMW－tsr表達載體的構建

硫鏈絲菌素抗性基因tsr的擴增引物tsr1：5′－ccCATATGactgagttggacacc－3′，tsr2：5′－ccTTAATTAAatcggttggccgc－3′。分別在基因上游引入NdeⅠ位點，下游引入PacⅠ位點。

從載體pZM中擴增得到tsr基因片段，25μL反應體系中含10×LA－Taq酶緩沖溶液2.5μL、2.5 mmol·L－1dNTP 2μL、10μmol·L－1引 物 各0.5μL、LA－Taq酶0.2μL、模板質粒30ng。擴增條件為：95℃預變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min。tsr片段經純化后克隆至pGEM－T載體中。使用內切酶NdeⅠ與PacⅠ將tsr片段切下，同時用這兩種酶處理載體pZMW；連接構建pZMW－tsr表達載體。將pZMW－tsr轉入大腸桿菌ET12567（pUZ8002）。

1.4 [γHyMeLeu4］CyA生產菌CYA4OH 的接合轉移

單孢子懸液制備：菌種培養(yǎng)使用MS培養(yǎng)基，加水從斜面上洗下孢子。將斜面孢子打散、過濾、分裝，用2×YT培養(yǎng)基洗滌1次，重懸于500μL 2×YT培養(yǎng)基中，50℃熱激15min。每次反應孢子用量約2×108個。

接合轉移：將大腸桿菌 ET12567（pUZ8002，pZMW－tsr）在LB培養(yǎng)基（卡那霉素25μg·mL－1，氯霉素25μg·mL－1，安普霉素25μg·mL－1）中37℃培養(yǎng)到對數(shù)生長期。取50mL菌液離心濃縮，用LB培養(yǎng)基洗滌2次，重懸于5mL LB培養(yǎng)基中。取500 μL懸液至單孢子懸液中，混勻，涂布于MS固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)18h后，加蓋安普霉素（25μg·mL－1）、硫鏈絲菌素（25μg·mL－1）和萘啶酮酸（25 μg·mL－1），30℃培養(yǎng)13d后檢測生長的單菌落。

1.5 轉基因菌株的培養(yǎng)

將CYA4OH轉基因單菌落接種于ISP2斜面培養(yǎng)基，待長出豐滿孢子后接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)44～48h。

1.6 轉基因菌株的PCR鑒定

收集菌絲，用生理鹽水洗2遍，取適量菌體液氮研磨。研磨好的菌體粉末按Easy－DNA試劑盒說明書提取基因組DNA。以CYA4OH基因組為模板，擴增體系及反應條件同步驟1.3，同時以載體pZM作陽性對照。

2 結果與討論

2.1 pZMW質粒在CYA4OH宿主菌中表達tsr

為了檢驗pZMW是否能夠通過接合轉移在CYA4OH中表達外源基因，選擇較易觀察轉化結果的tsr抗性基因作報告基因。用PCR方法從pZM質粒上擴增tsr抗性基因的編碼序列，并克隆于pZMW質粒的NdeⅠ和PacⅠ位點，構建了質粒pZMW－tsr。將pZMW－tsr轉入大腸桿菌 ET12567（pUZ8002），再通過接合轉移的方法將其轉入CYA4OH菌。結果表明，轉化菌能夠在含安普霉素與硫鏈絲菌素的培養(yǎng)基上生長，表明pZMW已經轉入宿主菌CYA4OH中，且PermE啟動子能在菌中表達外源基因tsr。

2.2 鑒定表達質粒在CYA4OH染色體上的整合

將2株CYA4OH轉化菌接入含25μg·mL－1硫鏈絲菌素的種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h后，提取基因組DNA。以提取的DNA為模板，用tsr抗性基因編碼序列引物tsr1、tsr2進行PCR擴增。結果表明，PCR產物大小與tsr編碼基因大小完全一致（圖1），表明質粒pZMW在CYA4OH菌中是整合到染色體上的。

圖1 轉化菌CYA4OH（pZMW－tsr）的PCR鑒定Fig.1 PCR Identification of CYA4OH（pZMW－tsr）

2.3 討論

野野村菌將CyA底物羥基化早有報道；CyA衍生物的傳統(tǒng)化學合成法轉化效率不高，產物不特異；采用微生物轉化的方式可以高效地將CyA底物轉化為其4－羥基衍生物，且轉化過程更加環(huán)保[3，6］。

為了研究CyA衍生物生產菌CYA4OH的轉化機制并對其進行基因工程改造，有必要建立其DNA轉移系統(tǒng)。建立宿主自身的基因轉移系統(tǒng)是基因鑒定、分析和其它遺傳操作的前提。接合轉移與通常使用的原生質體轉化方法相比，是一種操作簡單又高效的方法。本研究成功地將pZMW通過接合轉移轉入到稀有放線菌野野村菌CYA4OH中，并驗證了外源基因在菌體中的表達，為建立其遺傳操作體系進行了有意義的探索。

3 結論

將染色體整合型糖多孢紅霉菌表達載體pZMW－tsr轉入大腸桿菌ET12567（pUZ8002），以其作為供體，采用接合轉移的方法將硫鏈絲菌素抗性基因tsr轉入4－羥基環(huán)孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生產菌野野村菌CYA4OH中。PCR結果表明，基因已經整合到CYA4OH基因組上。研究表明pZMW載體能夠在稀有放線菌野野村菌中有效表達外源基因。

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[2]季新燕，溫耀明，陳振偉，等.環(huán)孢素的生物學活性及其衍生物的研究進展[J］.國外醫(yī)藥：抗生素分冊，2006，27（3）：116－121.

[3]Park N S，Myeong J S，Park H J，et al.Characterization and culture optimization of regiospecific cyclosporin hydroxylation in rare actinomycetes species[J］.J Microbiol Biotechnol，2005，15（1）：188－191.

[4]張部昌，李凌凌，于秀琴，等.糖多孢紅霉素表達載體pZMW的構建[J］.軍事醫(yī)學科學院院刊，2003，27（3）：176－179.

[5]張部昌，劉祚軍，曹孟嬋，等.糖多孢紅霉菌多拷貝表達載體pZM的構建[J］.中國生物工程雜志，2004，24（5）：43－46.

[6]Kuhnt M，Bitsch F，F(xiàn)rance J，et al.Microbial biotransformation products of cyclosporin A[J］.J Antibiot，1996，49（8）：781－787.