楊 琪, 信艷娟, Christopher FRANCO, 柯才煥, 張 衛(wèi),,

(1. 廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院, 福建 廈門 361005; 2. 中國(guó)科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所海洋生物產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室, 大連 116023; 3. Flinders Centre for Marine Bioproducts Development; 4. Department of Medical Biotechnology, School of Medicine, Flinders University, Adelaide, South Australia, 5042, Australia)

隨著陸棲微生物在抗生素、酶、酶抑制劑和多糖等生物活性物質(zhì)方面的大規(guī)模開(kāi)發(fā)和應(yīng)用, 通過(guò)尋找新種屬或特殊性狀的微生物來(lái)開(kāi)發(fā)新型天然活性物質(zhì)的難度越來(lái)越大。近年來(lái)研發(fā)重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了前景更為廣闊而研發(fā)較少的海洋微生物資源, 并成為海洋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)的主要內(nèi)容。作為海洋微生物資源開(kāi)發(fā)的前提, 海洋微生物多樣性的研究得到了迅速發(fā)展[1]。

海綿動(dòng)物是迄今已知海洋天然產(chǎn)物的最大來(lái)源。由于海綿的底棲過(guò)濾性攝食和選擇性消化等生理特性, 其體內(nèi)蘊(yùn)藏了豐富的微生物, 同時(shí)海綿中分離得到的豐富天然產(chǎn)物有許多是由其共生微生物產(chǎn)生的[2]。目前海綿相關(guān)微生物多樣性和活性產(chǎn)物的研究已經(jīng)獲得了很多成果。與活躍的海綿相關(guān)微生物研究相比較, 同屬于濾食性海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的海鞘動(dòng)物, 雖然已從其體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種生理活性物質(zhì)[3], 但是其相關(guān)微生物多樣性的研究仍處于起步階段, 研究報(bào)道極少。放線菌是一大類有生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)者, 目前所使用的抗生素中, 70%是由放線菌產(chǎn)生, 并且來(lái)源于海洋微生物的活性物質(zhì)中有一半以上來(lái)自放線菌[4]。

因此, 真正全面認(rèn)識(shí)海鞘相關(guān)放線菌的多樣性,將海綿相關(guān)放線菌多樣性研究方法應(yīng)用于海鞘, 比較兩種動(dòng)物相關(guān)放線菌多樣性水平之間的差異, 獲得更多的放線菌資源并加以開(kāi)發(fā)應(yīng)用,是一個(gè)很有價(jià)值的研究課題。作者選取地域差別較大的中國(guó)福建東山灣海域的海綿(山海綿和網(wǎng)架海綿)和中國(guó)海南陵水海域的海鞘(皺瘤海鞘和乳突皮海鞘)為研究對(duì)象, 比較不同種屬之間及不同物種之間相關(guān)放線菌多樣性差異和特異性關(guān)系, 驗(yàn)證海鞘具有高的相關(guān)放線菌多樣性及存在種屬間差異的理論假說(shuō), 證明海鞘可作為除海綿之外另一個(gè)極具潛力的海洋放線菌和天然活性產(chǎn)物的來(lái)源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

海綿活體樣本采自福建古雷東山灣附近海域潮間帶, 經(jīng)鑒定為山海綿科(Mycalidae)的山海綿屬(Mycalesp.)(圖 1-A)和網(wǎng)架海綿科(Dictyonellidae)的網(wǎng)架海綿屬(Stylissasp.)(圖1-B)。海鞘活體樣本采自海南陵水縣附近水域, 經(jīng)鑒定為皺瘤海鞘(Styela plicata)(圖1-C)和乳突皮海鞘(Molgula manhattensis)(圖 1-D)。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道, 選擇4種有效放線菌分離培養(yǎng)基進(jìn)行改良, 制備 M1-M4, 另選用放線菌通用培養(yǎng)基高氏一號(hào)和細(xì)菌通用培養(yǎng)基2216E, 成分見(jiàn)表1。

Taq DNA聚合酶, HhaI(10 U/μL)由BioLabs提供;DNA純化試劑盒由 Mo BIO提供; DNA Marker由TakaRa提供; 16S rRNA 基因擴(kuò)增引物 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)、765R (5’- CTGT TTGCTCCCCACGCTTTC-3’)、704F (5’- GTAGCG GTGAAATGCGTA-3’)和 1492R (5’- CGGCTACCTT GTTACGAC-3’)由 GeneWorks提供。

圖1 海綿和海鞘樣品照片F(xiàn)ig. 1 Photos of sponges and ascidians

表1 海綿和海鞘放線菌分離培養(yǎng)基及其成分[5]Tab.1 Composition of six different kinds of media used for the isolation of actinomycetes from marine sponges and ascidians

1.3 海綿和海鞘中放線菌的分離、純化和保藏

將樣品在無(wú)菌條件下切塊, 洗滌, 除去表面附著的海水中微生物和其他雜質(zhì); 稱量樣品5.0 g加入5 mL無(wú)菌海水研成勻漿, 為0 #菌液。取1 mL 0#菌液加入9 mL無(wú)菌海水制成1 #菌液, 同樣方法制備2#菌液。分別取上述菌液 200 μL涂布培養(yǎng)基平板,每種濃度的菌液涂 3個(gè)平板; 置于 28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7天左右, 觀察菌落生長(zhǎng)情況。當(dāng)出現(xiàn)放線菌菌落后, 挑取單菌落劃線, 重復(fù)分離直至獲得純化菌株。挑取純化單菌落加入裝有1.8 mL 20%甘油水溶液的凍存管中, -80℃保藏。

1.4 基因組DNA提取和16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

取純化放線菌菌株2～3環(huán), 采用改良細(xì)菌基因組DNA提取方法提取放線菌基因組DNA[6]。用兩對(duì)引物27F和765R、704F和1492R分別擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR 反應(yīng)體系(50 μL): 5 μL 10 × ThermoPol Buffer, 1 μL dNTPs(各 10 mmol/L), 1 μL 引物27F(704F)和 1 μL 765R(1492R)(20 μmol/L), 2 μL 模板DNA(≥200 ng), 1 μL TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)和 39 μL的純水。PCR反應(yīng)條件: 94℃, 2 min; 94℃, 1 min, 52℃,1 min, 72℃, 2 min, 40個(gè)循環(huán); 72℃, 延伸10 min; 以20℃終止反應(yīng)。

1.5 16S rRNA基因限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)和序列分析

16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物在限制性內(nèi)切酶 HhaI作用下于37℃反應(yīng)16 h, 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。同時(shí)16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果與NCBI的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì), 用序列分析軟件MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離

根據(jù)菌落形態(tài)特征以及菌株基絲、氣絲的形態(tài)特征, 可判斷用 6種有效的分離培養(yǎng)基從山海綿和網(wǎng)架海綿中分別分離出放線菌 51株和 36株, 共計(jì)87株; 從皺瘤海鞘和乳突皮海鞘中分別分離得到放線菌80株和31株, 共計(jì)111株(表2)。

表2 海綿和海鞘在不同培養(yǎng)基中分離得到的放線菌數(shù)量Tab. 2 The number of actinobacteria isolated from sponges and ascidians in different isolation media

2.2 RFLP分析

將 198株放線菌的 16S rRNA基因進(jìn)行 HhaIRFLP分析。結(jié)果表明, 198株菌可分成38個(gè)RFLP圖譜類型(部分代表帶型見(jiàn)圖2-A和圖2-B), 有效的RFLP分組能將菌株初步歸類, 為選擇代表性菌株進(jìn)行測(cè)序提供依據(jù)。結(jié)合RFLP帶型和測(cè)序結(jié)果繪制表3和表4。

2.3 16S rRNA基因序列分析

圖2 網(wǎng)架海綿和皺瘤海鞘部分相關(guān)放線菌16S rRNA基因的RFLP代表性結(jié)果Fig. 2 Restriction fragment length polymorphism (RFLP)analysis of some representative actinobacteria isolated from marine sponge Stylissa sp. and marine ascidian Styela plicata

將測(cè)得的序列信息分別輸入 GenBank中比較,進(jìn)行屬一級(jí)的歸類, 并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3～圖6)。

表3 海綿相關(guān)放線菌16S rRNA基因的序列分析和RFLP分析Tab. 3 Sequence and RFLP analysis of 16S rRNA gene of actinobacteria from marine sponges Mycale sp. and Stylissa sp.

表4 海鞘相關(guān)放線菌16S rRNA基因的序列分析和RFLP分析Tab.4 Sequence and RFLP analysis of 16S rRNA gene of actinobacteria from marine ascidians Styela plicata and M. manhattensis

續(xù)表

圖3 山海綿放線菌16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Mycale sp. and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

測(cè)序結(jié)果表明, 55株代表性放線菌(從典型RFLP帶型和各種屬獨(dú)有帶型組中挑選)中有 12株屬于稀有放線菌, 其他屬于鏈霉菌, 該菌屬在 4個(gè)樣品中都表現(xiàn)出豐富的種類。12株稀有放線菌分屬以下7個(gè)屬: 擬諾卡氏菌、戈登菌、微桿菌、短桿菌、紅球菌、小單孢菌和節(jié)細(xì)菌。其中山海綿中得到擬諾卡氏菌、節(jié)細(xì)菌、戈登菌和微桿菌屬, 網(wǎng)架海綿中得到短桿菌; 皺瘤海鞘中得到擬諾卡氏菌、戈登菌、微桿菌、短桿菌和紅球菌, 乳突皮海鞘中得到小單孢菌。

圖4 網(wǎng)架海綿放線菌16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Stylissa sp. and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

3 討論

微生物與海鞘共生的現(xiàn)象能夠使海鞘產(chǎn)生具有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物, 有很多是具有價(jià)值的藥用化合物[7-9], 表現(xiàn)出抗腫瘤、抗病毒、抗微生物等生理活性, 以抗腫瘤活性最為引人注目[3]。但至今, 除證實(shí)海鞘有共生藍(lán)藻細(xì)菌外[10], 其相關(guān)微生物的研究并不多。文獻(xiàn)中應(yīng)用培養(yǎng)方法獲得了一種海鞘的微生物群落信息以及一些分離菌株[11-13]。但由于培養(yǎng)分離方法的局限性, 只能檢測(cè)到存在于特定生存環(huán)境中的少數(shù)微生物[14-15]。利用 DGGE、克隆和 16S rRNA基因測(cè)序等分子手段分析微生物群落, 發(fā)現(xiàn)似螺原體細(xì)菌在乳突皮海鞘的生殖腺中大量存在[16]。但文獻(xiàn)中對(duì)海鞘相關(guān)放線菌的報(bào)道極少。

本研究探討了海鞘中相關(guān)放線菌的多樣性, 是目前為止極少數(shù)海鞘相關(guān)微生物多樣性報(bào)道中專門針對(duì)放線菌的研究。Menezes等[17]用7種添加營(yíng)養(yǎng)豐富的人工海水并減少碳源的分離培養(yǎng)基從海鞘Didemnumsp.中分離出3個(gè)放線菌屬: 短小桿菌、微球菌和戈登菌。從海鞘Didemnum Ligulum中分離出4個(gè)放線菌屬: 短小桿菌、節(jié)細(xì)菌、短桿菌和諾卡氏菌。而本研究從皺瘤海鞘中分離出6個(gè)放線菌屬, 從乳突皮海鞘中得到 2個(gè)放線菌屬, 可初步驗(yàn)證海鞘具有高的放線菌多樣性, 且存在顯著的種屬間差異,其中皺瘤海鞘相關(guān)放線菌的多樣性是目前為止海鞘個(gè)體中可培養(yǎng)放線菌多樣性最高的研究結(jié)果?？梢?jiàn)分離培養(yǎng)結(jié)合 16S rRNA基因測(cè)序的方法能很好的揭示海鞘相關(guān)放線菌的多樣性, 并且所選用的 6種分離培養(yǎng)基能夠有效分離海鞘中相關(guān)放線菌, 優(yōu)于其他研究中的分離培養(yǎng)基。

圖5 皺瘤海鞘放線菌16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with Styela plicata and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

海綿來(lái)源的放線菌多樣性研究已經(jīng)廣泛開(kāi)展,目前已分離出纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、酸微菌屬(Acidimicrobium)、考克氏菌屬(Kocuria)、疣胞菌屬(Verrucosispora)等22個(gè)屬[18]。張海濤等[19]用16S rRNA基因擴(kuò)增和RFLP及測(cè)序分析相結(jié)合的方法從大連海域繁茂膜海綿中分離出 7個(gè)放線菌屬。信艷娟等從大連海域繁茂膜海綿中篩選放線菌 9個(gè)屬[2],是目前多樣性最高的研究結(jié)果。本研究從山海綿中分離出5個(gè)放線菌屬, 網(wǎng)架海綿中分離出2個(gè)放線菌屬, 雖然數(shù)量并不是最多, 但可表明海綿相關(guān)放線菌高的多樣性水平。進(jìn)而與海鞘相關(guān)放線菌多樣性平行對(duì)比, 證明海鞘中具有豐富的放線菌資源, 在本研究中還表現(xiàn)出高于海綿來(lái)源的放線菌多樣性, 是一種很有潛力的放線菌來(lái)源。同時(shí), 海鞘中發(fā)現(xiàn)8種可能的新放線菌菌株, 數(shù)量上遠(yuǎn)高于在海綿(2種)中的發(fā)現(xiàn)。

比較海綿之間、海鞘之間相關(guān)放線菌多樣性, 可發(fā)現(xiàn)無(wú)論數(shù)量上還是多樣性水平上都存在顯著性差異(表3和表4)。這可能與其生長(zhǎng)環(huán)境和生理結(jié)構(gòu)的差異有密切關(guān)聯(lián)。質(zhì)地松軟, 濾水系統(tǒng)發(fā)達(dá), 生活于潮間帶的山海綿比質(zhì)地堅(jiān)硬、骨針結(jié)構(gòu)多的網(wǎng)架海綿更易富集海水中的微生物, 同時(shí)表面粗糙的皺瘤海鞘則比表皮光滑透明的乳突皮海鞘容易積累微生物, 因而表現(xiàn)出更高的可培養(yǎng)放線菌多樣性。但是,更重要的原因是研究手段的局限性, 分離培養(yǎng)手段無(wú)法獲得稀有的難培養(yǎng)的種類。高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能比較適合生長(zhǎng)速度快且對(duì)高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有適應(yīng)能力的放線菌, 但對(duì)生長(zhǎng)速度較慢的放線菌則可能有抑制作用[20-21]。特別是放線菌可以“活的非可培養(yǎng)”狀態(tài)存在[22], 這更增加了培養(yǎng)難度。因此, 基于目前使用的分離培養(yǎng)方法并不能全面準(zhǔn)確的反映海綿和海鞘中放線菌的多樣性信息, 仍需應(yīng)用新的分子多樣性研究與培養(yǎng)相結(jié)合的方法進(jìn)一步深入研究。

圖6 乳突皮海鞘放線菌16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig. 6 Neighbor-joining phylogenetic representation of actinobacteria associated with M. manhattensis and their closest NCBI(BLASTn)relatives based on 16S rRNA gene sequences

Li等[23]和 Webster等[24]都利用添加海綿組織提取液的放線菌培養(yǎng)基, 成功分離到稀有放線菌以及先前沒(méi)有分到的菌株。這也為今后的分離培養(yǎng)研究提供了可選擇的思路。同時(shí)也需結(jié)合分子生物學(xué)的研究手段從基因角度分析, 與分離培養(yǎng)方法互為補(bǔ)充, 提供分子信息指導(dǎo), 以期獲得更全面更準(zhǔn)確的海綿和海鞘相關(guān)放線菌多樣性信息, 真正驗(yàn)證海鞘相關(guān)放線菌的多樣性及其特有的新菌種資源。

4 結(jié)語(yǔ)

作者用 6種有效的分離培養(yǎng)基從兩種海綿和兩種海鞘中分別分離出87株和111株放線菌, 其中有10株為潛在的新菌株, 為海洋放線菌的開(kāi)發(fā)利用提供了潛在的新資源。與海綿中分離得到的 6個(gè)放線菌屬和2個(gè)可能的新菌株相比, 從海鞘中分離到了7個(gè)放線菌屬和 8個(gè)可能的新株。表明海鞘具有較高的放線菌多樣性水平, 是除海綿之外另一個(gè)極具潛力的海洋放線菌來(lái)源, 可成為開(kāi)發(fā)海洋未知放線菌菌株以及海洋天然活性產(chǎn)物的新方向和儲(chǔ)備資源。

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