賴水發(fā), 陳 新, , 彭明棟, 張彬山, 王 芳, 張哲進, 唐 敏,

(1. 海南大學 材料與化工學院, 海南 ?？?570228 ; 2. 海南大學 熱帶島嶼資源先進材料教育部重點實驗室,海南 ?？?570228; 3. 海南大學 海洋學院, 海南 ?？?570228)

碳酸鈣是自然界生物礦化物的重要組成之一,無脊椎動物的很多鈣化結構, 如軟體動物的外殼、鈣質海綿綱的骨針、珊瑚的外骨骼以及部分甲殼動物外殼等的主要無機成分都是碳酸鈣, 含量?？蛇_90%以上[1]。這些礦化組織作為可再生的優(yōu)質鈣源,在化工、醫(yī)藥及材料等領域應用廣泛[2-3]。此外, 生物礦化形成的碳酸鈣一般是高度有序的結晶復合體,常具有一些特殊的理化性質, 如強度比普通的碳酸鈣晶體礦物高約1 000～3 000倍[4-5], 這對生物仿生學研究具有很好的啟示作用, 引起了生物、材料及建筑等領域學者們的普遍關注[6-7]。

雙殼貝類因具有很高的經(jīng)濟價值和巨大的養(yǎng)殖規(guī)模, 目前是海洋經(jīng)濟資源種類的主要研究和開發(fā)對象, 國內外對經(jīng)濟貝類的礦化成分、結構及其礦化機理進行了廣泛而深入的研究, 取得了一系列有價值的成果[8]。與貝類相比, 對甲殼類藤壺 (Balanus),外殼的礦化組織研究尚不多[9], 對其關注多集中在與生物污損密切相關的藤壺生態(tài)分布、粘附及藤壺膠等方面[10-11]。藤壺因其堅硬的石灰質外殼和牢固的粘附特性, 是危害嚴重的主要大型海洋污損生物之一, 一直是生物污損防除工作中亟待解決的難題。顯然, 對藤壺外殼的組成和結構進行深入研究將有利于更好地理解藤壺外殼的形成機理和控制因素,對采取有效的防污措施具有重要的啟迪意義, 這也對合理開發(fā)藤壺的經(jīng)濟價值和應用前景提供了重要的參考資料。此外, 近期研究發(fā)現(xiàn), 形成目前地球上主要三種生物礦化物(磷酸鈣、碳酸鈣和二氧化硅)的生物學機制, 幾乎是同期演化而成, 通過對藤壺碳酸鈣礦化結構及其機理的深入研究也將為動物進化研究提供一定的參考依據(jù)[5]。

本實驗采用的三種測定藤壺殼板碳酸鈣含量的方法, 即鈣黃綠素法、鈣-羧酸指示劑法和鉻黑 T指示劑法, 目前在化工或醫(yī)藥方面都較常使用[12], 但對藤壺殼板碳酸鈣含量的測定方面還未見報道, 對這三種方法的優(yōu)劣比較也未見分析。本實驗通過測定網(wǎng)紋藤壺殼板中碳酸鈣含量及其礦化微觀結構,以較全面地了解藤壺的礦化組織特征; 從精確、簡便而經(jīng)濟的角度綜合考慮, 優(yōu)選藤壺殼板碳酸鈣含量的測定方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料是南海近岸海域常見的網(wǎng)紋藤壺(Balanus reticulatesUtinomi), 采集于海南?？诤５閸u(20°1'N, 110°19'E)近岸海域的礁石表面和陵水貝類養(yǎng)殖場海域(18°15'N, 109°30'E)。將網(wǎng)紋藤壺及其固著的基底材料一起帶回實驗室, 選取底板直徑約在1 cm左右、發(fā)育正常的網(wǎng)紋藤壺, 仔細清洗去除其表面附著的泥污和其他雜物, 備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗樣品制備

將選取好的藤壺從其基底表面用機械外力取下,并清除藤壺內部臟器, 取殼板, 用流水清洗干凈,超聲波清洗兩次, 每次10 min, 然后用蒸餾水潤洗3遍。置于80℃烘箱烘干后待用。用于XRD的樣品機械切割成2 mm ×2 mm大小的方塊, 清洗干凈, 干燥備用。

用于碳酸鈣含量測定的樣品, 研磨成粉末, 過100目篩子。將四種樣品粉末標記、干燥、保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 礦化結構測定

結構測試采用X射線衍射分析(XRD儀)(Bruker D8 ADVANCE), 測試條件為CuKa射線, 掃描范圍2θ= 2°～70°, 掃描速度為3(°/min)。

1.2.3 碳酸鈣含量測定

采用三種方法, 即鈣黃綠素法、鈣-羧酸指示劑法和鉻黑T指示劑法來測定樣品中碳酸鈣的含量。實驗中使用的各試劑均為分析純, 除非特殊說明。

1.2.3.1 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)標準溶液的配制和標定

配制 EDTA 標準溶液, 稱取 EDTA-2Na·2H2O 約26.10 g, 溶于300 mL溫水中, 用蒸餾水稀釋至500 mL,混勻待用。

使用基準CaCO3對EDTA標準溶液進行標定[12]。根據(jù)耗用的EDTA標準溶液的體積, 計算出EDTA溶液的物質的量濃度為0.1402 mo1/L。

1.2.3.2 采用三種不同指示劑進行藤壺殼板含鈣量

的測定, 所用計算公式如下:

式中:x— CaCO3含鈣量(%)

V— EDTA標準溶液的體積(mL)

C— EDTA標準溶液的濃度(mol/L)

m— 樣品質量(g)

100.09 — CaCO3的摩爾質量

1.2.3.3 鈣黃綠素法

精確稱取每種樣品各4份, 每份約0.14 g左右,置錐形瓶中, 添加稀鹽酸5 mL, 加熱使之溶解, 繼續(xù)加熱至近干。加入100 mL蒸餾水和甲基紅指示劑2滴, 滴加6.5%氧氧化鉀溶液, 使溶液呈淺黃色, 再繼續(xù)加入10 mL后, 加鈣黃綠素指示劑適量, 此時溶液變成黃綠色, 上層呈綠色, 下層為黃色。用已標定的EDTA標準溶液滴定至黃綠色熒光消失并顯穩(wěn)定的橙色即可。記錄每次所用的EDTA溶液體積。

1.2.3.4 鈣-羧酸指示劑法

稱取樣品, 加鹽酸溶解同鈣黃綠素法。隨后添加100 mL蒸餾水和甲基紅指示劑2滴, 加10%三乙醇胺15 mL, 滴加10%氫氧化鈉溶液至溶液呈淺黃色, 再繼續(xù)加入10 mL后, 滴加鈣-羧酸指示劑10滴, 可見溶液呈現(xiàn)酒紅色。用已標定的EDTA標準溶液滴定至溶液由酒紅色變?yōu)榧兯{色即得。記錄每次所用的EDTA溶液體積。

1.2.3.5 鉻黑T指示劑法

精確稱取每種樣品各4份, 每份約0.5 g左右,置錐形瓶中, 加蒸餾水10 mL, 搖勻。加5 mL稀鹽酸使其完全溶解。加15 mL氨性緩沖液(pH=10)和1.5 mL三乙醇胺, 充分振搖后, 添加約0.01 g鉻黑T指示劑, 用已標定的EDTA標準溶液滴定至溶液由酒紅色變?yōu)榧兯{色。記錄每次所用的EDTA溶液體積。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用方差分析和t檢測方法分別對三種碳酸鈣含量測定方法、兩個不同地域的網(wǎng)紋藤壺中碳酸鈣含量進行比較和分析。

2 結果

2.1 藤壺殼板晶體結構特征

XRD結果顯示, 網(wǎng)紋藤壺殼板的礦化結構主要由方解石構成, 由各峰的分布情況和相對強弱, 可知方解石的分布存在一定的取向(圖1)。

圖1 網(wǎng)紋藤壺殼板礦化結構的XRD圖譜Fig.1 XRD diffraction patterns of the biomineralized plates of Balanus reticulates Utinomi (The continuous pattern is for the biomineralized plates, the other is the pattern of the calcite standard)

2.2 藤壺殼板碳酸鈣含量測定

經(jīng)測定, ?？诤土晁畠傻鼐W(wǎng)紋藤壺殼板的碳酸鈣含量均在90%以上, 最大值為93.87%, 最小值90.77% (表1、表2; 圖2、圖3)。

采用方差分析法, 比較3種碳酸鈣含量測定方法,發(fā)現(xiàn)在?？诤土晁? 這三種方法的測定結果都沒有顯著性差異(F?？? 1.904,F陵水= 3.126均小于F0.05,29=4.26)。

采用t檢測法比較?？诤土晁畠傻鼐W(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量的差異, 發(fā)現(xiàn)使用三種方法測定?？诤土晁畠傻氐木W(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量沒有顯著性的地區(qū)差異(表3)。

表1 不同方法測定的?？诘貐^(qū)網(wǎng)紋藤壺殼板的碳酸鈣含量(%)Tab. 1 The calcium carbonate content (%)of barnacle wall plate samples from Haikou by different testing methods

表2 不同方法測定的陵水地區(qū)網(wǎng)紋藤壺殼板的碳酸鈣含量(%)Tab. 2 The calcium carbonate content (%)of barnacle wall plate samples from Lingshui by different testing methods

圖2 三種方法測定海口地區(qū)網(wǎng)紋藤壺殼板的碳酸鈣含量Fig. 2 The calcium carbonate content (%)of barnacle wall plate samples from Haikou by different testing methods

圖3 三種方法測定陵水地區(qū)網(wǎng)紋藤壺殼板的碳酸鈣含量Fig.3 The calcium carbonate content (%)of barnacle wall plate samples from Lingshui by different testing methods

表3 t檢測法比較?？诤土晁畠傻鼐W(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量的地區(qū)差異性Tab. 3 Comparison of the calcium carbonate content (%)of barnacle wall plate samples from Haikou and Lingshui by t-test

3 討論

3.1 網(wǎng)紋藤壺殼板中礦化結構特征

網(wǎng)紋藤壺殼板的礦化結構主要由方解石構成,微結晶體的排列及其取向復雜。這與主要產(chǎn)自美洲的鸚南巨藤壺(Austromegabalanus psittacus)殼板的檢測結果類似[9]。但與大多數(shù)軟體動物的礦化外殼同時具有方解石和文石的結構有較大差異[3,13-15]。方解石是CaCO3晶體最穩(wěn)定的晶型, 有利于跟有機質結合形成穩(wěn)定的高性能復合物。本實驗中測得無機碳酸鈣含量在90%以上, 剩余的有機質含量應在10%以下。一般情況下, 礦化組織中有機質含量盡管很少, 但已在貝類, 腹足類動物的外殼研究中發(fā)現(xiàn)有機質對碳酸鈣微晶體的排列和生長起著重要的調節(jié)作用, 并影響其宏觀組織的力學性能[16-21]。故推測藤壺殼板中參與生物礦化的有機質與貝類的可能有較大差異, 亟待進一步的研究。網(wǎng)紋藤壺殼板中由方解石跟有機質構成的高級自組裝結構使其具有優(yōu)異的力學性能和理化性質。網(wǎng)紋藤壺主要生活在潮間帶和近岸淺水區(qū), 風浪沖刷腐蝕和退潮時的干燥環(huán)境使其生存面臨嚴酷的考驗, 堅韌的藤壺礦化外殼起了重要的保護作用, 這對網(wǎng)紋藤壺能適應苛刻的生活環(huán)境并廣泛分布意義重大。

3.2 比較三種碳酸鈣含量測定方法

滴定試驗結果的精密度和準確度與檢測終點的方法密切相關, 所以如何選擇適宜的指示劑靈敏地確定終點是實驗的關鍵。鈣黃綠素法、鈣-羧酸指示劑法和鉻黑T指示劑三種方法都屬于EDTA絡合滴定法, 主要差異體現(xiàn)在指示劑的不同。

實驗結果顯示, 在檢測?？诨蛄晁貐^(qū)的藤壺殼板碳酸鈣含量時, 鈣黃綠素法、鈣-羧酸指示劑法和鉻黑 T指示劑三種方法的測定結果在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異。這一方面表明, 這三種方法均可用于藤壺殼板碳酸鈣含量的測定, 都能獲得較精確的結果, 重復性較好(表1和表2); 另一方面, 三種檢測方法能獲得無顯著性差異的實驗結果也相互驗證了本次實驗過程及結果的可靠性。

進一步分析比較實驗結果, 可以發(fā)現(xiàn), 在三種方法中鈣黃綠素法測定結果的標準誤差最小, 可見采用該方法測定藤壺殼板中碳酸鈣含量可獲得重復性好的測量結果。鈣黃綠素, 即3, 3'-雙(甲胺二乙酸)熒光素, 是一種絡合熒光指示劑。其鈉鹽在酸性條件下呈黃色, 堿性時呈淡紅色。pH ＜ 11時, 鈣黃綠素本身具有黃綠色熒光, Cu、Fe、Al、Pb、Mn等離子是其熒光淬滅劑; 當pH ＞ 12時, 鈣黃綠素需跟一些離子絡合后才能產(chǎn)生熒光, 其中與Ca的絡合反應非常靈敏, 可達0.08 μg的水平[19,22]。本實驗中, 當用EDTA滴定至終點時, 因Ca不再與熒光指示劑結合而使溶液顏色由黃綠色變?yōu)榈t色, 可非常靈敏地指示出終點。鈣-羧酸指示劑, 即2-羥基-1-(2-羥基-4-磺基-1-萘基偶氮)-3-萘甲酸。pH ＜ 10時呈紅色, pH ＞13為淺藍色, 能和鈣形成紅色螯合物, 可較靈敏地顯示終點, 但其反應會受到Mg的影響。鉻黑T是一種偶氮染料, 溶于水中不穩(wěn)定, 易發(fā)生聚合反應和氧化反應; 鉻黑T的滴定終點不太明顯, 在本實驗中也呈現(xiàn)出較大的標準誤差。此外, 如果溶液中有少量的其他離子, 如Fe3+、Cu2+、Al3+等時, 會產(chǎn)生封閉現(xiàn)象, 使終點不敏銳[23]。所以, 從檢測的精確度出發(fā), 測定網(wǎng)紋藤壺殼板中碳酸鈣含量時可優(yōu)先考慮采用鈣黃綠素法。

3.3 網(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量的地區(qū)差異比較

通過檢測和數(shù)據(jù)分析, 可知?？诤土晁畠傻氐木W(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量沒有呈現(xiàn)出顯著性的地區(qū)差異。盡管兩地的生境和氣候有一定差別, 但對網(wǎng)紋藤壺殼板碳酸鈣含量沒有顯著影響, 這可能與藤壺較強的適應性以及鈣代謝的穩(wěn)定性相關。實驗結果也初步表明影響碳酸鈣測定結果的Fe3+、Cu2+、Al3+等離子, 可能在這兩個地區(qū)生長的網(wǎng)紋藤壺殼板中的差異不大, 不會對碳酸鈣的測定結果造成顯著影響。考慮到本次實驗所測定網(wǎng)紋藤壺的數(shù)量有限, 故詳實確鑿的結論還需今后進一步廣泛采集樣本進行研究和比較。

本實驗從碳酸鈣含量和礦化結構特征兩個方面初步研究了網(wǎng)紋藤壺殼板。實驗發(fā)現(xiàn)網(wǎng)紋藤壺殼板礦化組織主要由方解石構成, 其微晶體排列取向較為復雜。?？诤土晁畠傻靥賶貧ぐ逯刑妓徕}含量沒有顯著差異(P＜0.05), 最大值為 93.87%, 最小值為90.77%。盡管三種碳酸鈣含量測量法(鈣黃綠素法、鈣-羧酸指示劑法和鉻黑 T指示劑法)結果沒有顯著性差異(P＜0.05), 但進一步綜合分析發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素法測定結果最為穩(wěn)定, 且易操作, 可作為首選方法。實驗結果將為今后進一步研究藤壺礦化結構以及通過控制礦化過程達到防污的新思路探索方面提供參考資料。此外, 實驗結果在生物仿生和可再生碳酸鈣資源的利用方面也具有一定的參考價值。

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