史松富, 姚韓韓, 林志華, 周小龍, 齊曉艷, 董迎輝

(1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn), 浙江 寧波 315100; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 3. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 寧波 315211)

微衛(wèi)星標(biāo)記又稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple seque ncerepeat, SSR), 其核苷酸序列是以2～6個(gè)核苷酸為一個(gè)單位重復(fù)排列。微衛(wèi)星因其在基因組中分布廣泛、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好以及實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn), 已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳連鎖圖構(gòu)建、QTL定位以及物種親緣關(guān)系鑒定[1-3]。SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與分析在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[4-5]、泥蚶(Tegillarca granosa)[6-7]、魁蚶(Scapharca brougtonii)[8]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[9-10]、文蛤(Meretrixmeretrix)[11]等海洋雙殼貝類(lèi)中已有報(bào)道。

泥蚶(Tegillarca granosa), 俗稱(chēng)血蚶、花蚶、粒蚶,為我國(guó)四大海水養(yǎng)殖貝類(lèi)之一。泥蚶肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富, 市場(chǎng)前景廣闊。關(guān)于泥蚶分子標(biāo)記的研究已有很多報(bào)道, 如李太武等[12]利用RAPD標(biāo)記技術(shù)分析了5個(gè)泥蚶群體的遺傳多樣性, 姚韓韓等[13]利用 AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)泥蚶4個(gè)快速生長(zhǎng)家系的遺傳變異進(jìn)行了分析, 顧曉英等[14]通過(guò)磁珠富集法篩選了6對(duì)多態(tài)性SSR引物; 董迎輝等[6]利用泥蚶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)開(kāi)發(fā)了34個(gè)EST-SSR標(biāo)記, Liu 等[7]開(kāi)發(fā)了39個(gè)泥蚶EST-SSR位點(diǎn)。本研究在泥蚶轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的基礎(chǔ)之上, 探討利用單拷貝序列篩選SSR標(biāo)記的可行性及優(yōu)缺點(diǎn), 為泥蚶的種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建以及種群鑒定提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與DNA提取

實(shí)驗(yàn)樣品采自浙江寧波奉化海區(qū), 隨機(jī)取樣 30粒, 活體解剖后取其閉殼肌, 保存于-20℃冰箱中備用。采用酚-氯仿法提取基因組DNA, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA的質(zhì)量, 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度與濃度, 調(diào)節(jié)DNA濃度最終為100 ng/μL。

1.2 候選SSR位點(diǎn)的獲得與引物設(shè)計(jì)

用SSR Hunter1.3軟件在單拷貝序列中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn), 篩選標(biāo)準(zhǔn)為二堿基、三堿基、四堿基、五堿基重復(fù)單元重復(fù)至少依次為 6、4、3、3次, 側(cè)翼序列大于150 bp。利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物, 引物長(zhǎng)度18～24 bp, GC含量40%～60%, 引物由上海生工合成(表 1)。

1.3 泥蚶候選SSR位點(diǎn)檢測(cè)與PCR擴(kuò)增

隨機(jī)取6個(gè)泥蚶DNA混成基因池, 對(duì)所有引物進(jìn)行初步篩選。PCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括100 ng DNA, 0.2 mmol/L dNTP, 0.5U Taq 酶, 10×PCR buffer, 上游引物與下游引物各1 μmol/L, 1.5 mmol/L MgCl2。PCR反應(yīng)條件: 94℃變性5 min; 94℃變性45 s,退火45 s, 72℃ 45 s, 共35循環(huán); 72℃延伸8 min; 4℃保存。每對(duì)引物所需的退火溫度見(jiàn)表1。用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,電泳緩沖液為 1×TBE, 電壓為 180 V, 電泳時(shí)間為3～4 h, EB染色, 用Biorad 凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果。

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1.4 泥蚶SSR位點(diǎn)分析

利用篩選的引物對(duì)泥蚶30個(gè)個(gè)體進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè), 用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。用CERVUS 3.0軟件處理結(jié)果, 獲得重要的遺傳學(xué)參數(shù): 等位基因數(shù)(Na)、期望雜合度(He)、觀測(cè)雜合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)。用在線軟件 GENEPOP進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)檢測(cè), 利用 Bonferroni correction法對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

2.1 泥蚶SSR位點(diǎn)的篩選

利用SSR Hunter1.3軟件搜索3000條單拷貝序列(singleton), 獲得132條含有SSR位點(diǎn)的序列, 成功設(shè)計(jì)引物有 50條, 成功率為 37.88%; 利用 Primer5.0在各SSR位點(diǎn)兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物, 41對(duì)引物獲得穩(wěn)定清晰的條帶; 在泥蚶群體中對(duì)41對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè), 24對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為多態(tài)性。

在24個(gè)EST-SSR位點(diǎn)中, 三堿基重復(fù)類(lèi)型的最多為18個(gè), 占總SSR的75%; 其次二堿基重復(fù)類(lèi)型的SSR有4個(gè), 占總數(shù)的16.67%; 四堿基與五堿基重復(fù)類(lèi)型的 SSR最少均為 1個(gè), 均占總多態(tài)位點(diǎn)的4.17%(圖 1)。

圖1 泥蚶24個(gè)EST-SSR位點(diǎn)的核苷酸重復(fù)堿基的分布特征Fig. 1 Distribution of 24 EST-SSR motifs types in Tegillarca granosa

2.2 24個(gè)SSR位點(diǎn)對(duì)泥蚶群體的多態(tài)性評(píng)價(jià)

24個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在泥蚶 30個(gè)個(gè)體中共獲得 84個(gè)等位基因, 多態(tài)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～5個(gè), 平均等位基因數(shù)為 3.5 個(gè), 其中 Tg02、Tg03、Tg08、Tg16、Tg19、Tg23六個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為5個(gè)。觀測(cè)雜合度、期望雜合度分別為 0.000～0.591、0.045～0.727(表1)。PIC值是衡量群體變異程度的重要參數(shù)[15], 24個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的PIC值介于0.043～0.696,平均值為 0.391, 其中有 11個(gè)高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC＞0.5)、 4個(gè)中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25＜PIC＜0.5)、9個(gè)低度多態(tài)位點(diǎn)(PIC＜0.25)。各多態(tài)位點(diǎn)經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢測(cè), 并用 Bonferroni correction法進(jìn)行校正, 除Tg10、Tg11、Tg12、Tg17、Tg18、Tg21、Tg24 之外, 其余位點(diǎn)均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

3 討論

目前SSR開(kāi)發(fā)主要是基于構(gòu)建的基因組文庫(kù)和EST文庫(kù), EST-SSR的開(kāi)發(fā)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、高效率等特點(diǎn), 越來(lái)越受到研究者的青睞。在海洋貝類(lèi)中, 利用EST文庫(kù)篩選SSR的研究已較深入, 如Wang等[16]利用從文蛤EST文庫(kù)篩選出2970個(gè)候選SSR位點(diǎn); Hou等[17]通過(guò)蝦夷扇貝轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)得到2700個(gè)SSR候選位點(diǎn)。本研究在泥蚶轉(zhuǎn)錄組的單拷貝序列(singleton)中篩選SSR位點(diǎn), 并將相關(guān)信息與從重疊群(contig)中篩選SSR位點(diǎn)的研究相比較, 分析singleton與contig篩選SSR位點(diǎn)的差異。

本研究利用泥蚶singleton篩選的SSR引物設(shè)計(jì)成功率為 37.88%, 董迎輝等[6]利用泥蚶 contig篩選SSR位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)成功率 73.97%, 引物設(shè)計(jì)成功率較低的原因有: (1)singleton的序列長(zhǎng)度較短, 泥蚶singleton的平均長(zhǎng)度為285.46 bp[18], 用于設(shè)計(jì)引物的區(qū)域相對(duì)較小, 而contig的平均長(zhǎng)度為964.2 bp。(2)singleton中的一小部分被認(rèn)為是在測(cè)序過(guò)程中被其他生物的序列污染或者是人工序列的產(chǎn)生[17]。

singleton來(lái)源的SSR同contig來(lái)源的SSR一樣能反映生物群體的重要遺傳學(xué)信息, 單拷貝序列的充分利用有利于群體的遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源的保護(hù)等, 如董迎輝等[6]利用 contig篩選 34個(gè)EST-SSR的研究中平均等位基因數(shù)為 3.59、平均多態(tài)信息含量為 0.396、平均期望雜合度為 0.447, Liu等[7]關(guān)于39個(gè)EST-SSR的研究中平均等位基因數(shù)、平均多態(tài)信息含量、平均期望雜合度分別為 3.9、0.402、0.449, 本實(shí)驗(yàn)利用singleton篩選的24個(gè)SSR多態(tài)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為3.5、平均多態(tài)信息含量0.391、平均期望雜合度0.434。 目前EST-SSR篩選主要來(lái)自contig, 而關(guān)于singleton的開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及與contig的比較研究較少。本研究證實(shí)利用singleton開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記是可行的, singleton在轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中所占的比例較大且包含豐富的遺傳信息, 特別在表達(dá)豐度較低基因的開(kāi)發(fā)方面較 contig具有更重要的應(yīng)用價(jià)值[17]。

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