陳 志, 高如承, 胡 青, 李 鵬, 賴素蘭

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108)

波紋巴非蛤(Paphia undulata)是一種肉質(zhì)細(xì)嫩、口感鮮美、營養(yǎng)豐富的海產(chǎn)雙殼貝類。隸屬于軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 簾蛤目(Veneroida), 簾蛤科(Veneridae), 巴非蛤?qū)?Paphia),俗稱“花蚶”、“油蛤”。它是一種暖水性淺海底棲貝類, 大都生活于大潮時(shí)水深0.5～3.5 m的潮下帶淺海底部軟泥中, 最深可分布到10 m水深。它具有高蛋白質(zhì)、低脂肪的特點(diǎn)[1], 除了富含有多種氨基酸以外,還含有氨基多糖和牛磺酸, 易被腸道消化吸收, 食療藥用價(jià)值較高, 具有抗腫瘤、降低血糖和改善糖尿病癥狀等作用[2]。目前對波紋巴非蛤的研究涉及眾多領(lǐng)域, 包括形態(tài)學(xué)[3-4]、繁育生物學(xué)[5-6]、生理學(xué)[7]、分子免疫學(xué)[8-9]、生態(tài)學(xué)[10]、食品開發(fā)與應(yīng)用[1]、養(yǎng)殖技術(shù)與應(yīng)用[11-12]等。

響應(yīng)面法(Response Surface Methodolody, 簡稱:RSM)是先進(jìn)行合理的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì), 后通過實(shí)驗(yàn)論證得到相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù), 采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系, 通過對回歸方程各參數(shù)的分析來尋求最優(yōu)參數(shù)并解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[13-14]。應(yīng)用軟件系統(tǒng)對試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 觀察響應(yīng)面[15], 利用軟件提供的三維立體圖形和二維等高線圖, 最優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面法具有次數(shù)少、周期短, 所得回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn), 可以研究幾種因素間的交互作用[16]。本文利用響應(yīng)面法, 探討溫度、鹽度和密度對波紋巴非蛤幼貝生長的聯(lián)合作用, 構(gòu)建波紋巴非蛤幼貝生長模型并優(yōu)化其生長條件, 以期對波紋巴非蛤大規(guī)模人工養(yǎng)殖提供科學(xué)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用波紋巴非蛤幼貝均來自福建宏峰泰海洋生物開發(fā)有限公司育苗基地, 于2012年6月人工育苗成功, 選取殼長相近的幼貝用于實(shí)驗(yàn), 隨機(jī)抽取100粒幼貝測量殼長, 平均殼長為4.94 mm±0.07 mm。模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取同批次幼貝, 幼貝規(guī)格與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)開始時(shí)基本相同, 隨機(jī)抽取30粒幼貝測量殼長,平均殼長為5.04 mm±0.06 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)

在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上, 選取溫度、鹽度和密度3個(gè)影響因子的實(shí)驗(yàn)組, 根據(jù)Box-Benhnken的中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平(3因素為溫度(A),鹽度(B), 密度(C); 3水平為－1, 0, 1)的二次多項(xiàng)回歸組合實(shí)驗(yàn), 探索波紋巴非蛤幼貝生長的最優(yōu)條件。實(shí)驗(yàn)在500 mL燒杯中進(jìn)行, 燒杯底部鋪設(shè)5 mm厚的底泥。不同溫度梯度由恒溫水槽控制, 通過添加淡水至天然海水(鹽度為32～33)中配置不同鹽度梯度。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 20 d, 每天早晚投喂塔胞藻(Pyramidomonassp.),各實(shí)驗(yàn)組投喂餌料相同, 并在投喂前將藻液鹽度調(diào)至與實(shí)驗(yàn)組相同。響應(yīng)面影響水平、因素編碼及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1和表2。

表1 實(shí)驗(yàn)水平和因素設(shè)計(jì)Tab. 1 Factors and levels of the experiment

表2 響應(yīng)面3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab. 2 The experiment design of 3 factors and 3 levels of RSM

1.2.2 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)條件按照響應(yīng)面優(yōu)化得出的最適生態(tài)環(huán)境條件進(jìn)行, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行, 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相同, 為期 20 d, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各平行組的平均殼長和死亡個(gè)體數(shù)。

1.3 計(jì)算公式與數(shù)據(jù)分析

生長率:Rg=(L－L0)/L0

存活率:Rs=(D－D0)/D0

公式中L0,L分別表示實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)幼貝的殼長(單位: mm),D0,D分別表示實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)幼貝個(gè)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件SPSS17.0進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及單因素方差A(yù)NOVA分析, 獨(dú)立樣本均數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn), 其中P＜ 0.05認(rèn)為有顯著差異,P＜ 0.01認(rèn)為差異極顯著。采用SAS 9.2軟件對響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合、方差分析、顯著性檢測和響應(yīng)面法分析。

2 結(jié)果

2.1 回歸模型和回歸方程的建立

綜合單因素影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 以幼貝生長率為響應(yīng)值。采用SAS 9.2軟件計(jì)算多元回歸擬合, 建立二元回歸方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Experimental result and scheme of RSM

通過 SAS軟件的響應(yīng)面回歸過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 建立二次響應(yīng)面回歸模型, 求出最優(yōu)相應(yīng)因子水平。擬合得到的生長率(Y)對A,B,C的回歸方程為:

2.2 回歸方程系數(shù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)

利用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件對Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的各組合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多元回歸分析(表 4)。

表4 二次多項(xiàng)式模型方差分析和多元回歸分析Tab. 4 Variance analysis of quadratic equation and significance test of regression

由表4可以看出, 本實(shí)驗(yàn)總模型回歸顯著性檢測P值為0.0005, 遠(yuǎn)小于0.01, 失擬項(xiàng)顯著性檢測P值為0.0695, 說明模型失擬不顯著, 回歸極顯著, 擬合方程可靠, 線性回歸(P=0.0005＜0.01)、二次回歸(P=0.0024＜0.01)和交互(P=0.0006＜0.01)都極顯著。說明模型是可行的。模型的校正決定系數(shù)為R2adj=0.9574, 說明該模型可以解釋95.74%影響值的變化, 只有4.26%不可以用于該模型。決定系數(shù)R2=0.9848, 說明該模型擬合程度良好, 實(shí)驗(yàn)誤差很小, 可以用來分析和預(yù)測波紋巴非蛤幼貝生長率。從回歸方程各項(xiàng)系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知, 一次項(xiàng)A顯著,B,C極顯著; 交互項(xiàng)AB,BC極顯著,AC不顯著; 二次項(xiàng)A2,B2極顯著,C2不顯著。綜合以上數(shù)據(jù)分析結(jié)果, 可以看出3種生態(tài)因子對幼貝生長率影響的大小順序是:B＞A＞C。

2.3 波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面分析

圖1 密度和溫度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 1 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of density and temperature on Paphia undulata growth rate

三維響應(yīng)面和二維等高線圖可以用來評價(jià)不同因子之間的相互作用對響應(yīng)值的影響。三維響應(yīng)面和二維等高線圖能夠直觀地表現(xiàn)出波紋巴非蛤幼貝生長率隨溫度、密度、鹽度的不同而產(chǎn)生的變化趨勢。溫度和密度不存在顯著交互作用(圖1)。從溫度和鹽度交互作用的響應(yīng)面圖可以看出, 響應(yīng)面分析圖呈現(xiàn)山丘形曲面, 從等高線圖看出, 等高線呈橢圓形, 溫度和鹽度存在顯著交互作用, 生長率有極大值(圖 2)。鹽度和密度存在一定的交互作用(圖3), 但響應(yīng)面沒有呈現(xiàn)出明顯山丘形。從各圖中最佳生長率相對于等高線位置的變化可以看出,鹽度對幼貝生長率影響最大, 溫度次之, 密度影響最小。

圖2 鹽度和溫度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 2 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of salinity and temperature on Paphia undulata growth rate

圖3 密度和鹽度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of density and silinity on Paphia undulata growth rate

通過對SAS9.2軟件模擬出的三維響應(yīng)面圖和等高線分析可以得出,ABC對應(yīng)的編碼值分別為A=-0.534,B= 0.696547,C= -0.6048, 根據(jù)回歸方程中的系數(shù)計(jì)算出的實(shí)際值溫度為 26.93℃、鹽度為31.39、密度為 1.12個(gè)/cm2, 理論最佳生長率為41.47%。

2.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對模型預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

將模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果進(jìn)行對比(表 6)。從表中可以看出, 實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果和預(yù)測結(jié)果基本一致, 生長率僅相差0.83%, 所以響應(yīng)面法較為可靠。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Tab. 5 Demonstration of test result

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果的對比Tab. 6 Comparison of the best condition and the predicted condition

3 討論

溫度和鹽度是影響海洋無脊椎動物胚胎發(fā)育和生長的重要因子, 有關(guān)溫度和鹽度對海洋雙殼貝類的影響常見于單因子實(shí)驗(yàn)分析, 溫度和鹽度對櫛江珧(Atrina pectinata)[17]、織錦巴非蛤(Paphia textzle)[18]、毛蚶(Scapharca subcrenata)[19]等的單一因素影響均有報(bào)道, 但針對溫度和鹽度兩者對海洋雙殼貝類聯(lián)合作用的研究則相對較少, 目前有針對華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)[20]的報(bào)道, 密度因子對貝類生長的影響主要通過個(gè)體之間直接對空間和食物的競爭和對環(huán)境的影響反作用于自身的生長。養(yǎng)殖密度對貝類生長的影響前人已做過大量的研究,例如, 青蛤(Cyclina sinensis)稚貝不同放養(yǎng)密度的試驗(yàn)結(jié)果表明[21], 青蛤稚貝的生長受到了放養(yǎng)密度的制約, 低密度養(yǎng)殖時(shí)其瞬時(shí)生長率最高, 隨著放養(yǎng)密度的增加, 瞬時(shí)生長率逐漸下降, 死亡率上升。

雖然在單因素實(shí)驗(yàn)中, 溫度、鹽度和密度均對波紋巴非蛤幼貝生長有顯著影響, 但它們之間的交互作用對幼貝生長的影響有所不同。密度與相關(guān)生態(tài)因子聯(lián)合作用對貝類影響的報(bào)道也相對較少。對毛蚶的研究表明, 在適宜的范圍內(nèi), 鹽度和溫度對毛蚶受精卵孵化和幼蟲生長交互作用不顯著, 但將其中一個(gè)條件設(shè)為極限時(shí), 交互作用顯著[22]。王雅倩等[23]對中國蛤蜊(Mactra chinensis)的研究顯示, 個(gè)體質(zhì)量和溫度交互對中國蛤蜊的耗氧率和排氨率的影響顯著(P＜0.05)。桑士田等[24]研究了溫度、鹽度及pH交互作用對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)稚貝生長的影響, 結(jié)果表明, 溫度、鹽度及pH三者間對蛤仔稚貝生長無顯著交互作用。

本文對波紋巴非蛤的研究發(fā)現(xiàn), 溫度和鹽度、鹽度和密度對幼貝生長影響極顯著, 而溫度和密度影響不顯著, 說明鹽度對幼貝的生長是至關(guān)重要的。波紋巴非蛤是一種暖水性、在淺海生活的貝類, 對高鹽的耐受能力要強(qiáng)于對低鹽的耐受能力。李文波[25]研究了溫度對波紋巴非蛤消化酶的影響, 認(rèn)為波紋巴非蛤腸淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的活力最適溫度分別為40, 55, 30℃, 波紋巴非蛤成貝耐受的極限溫度范圍一般為 5～31℃, 最適溫度為 20～28℃[11]。響應(yīng)面預(yù)測實(shí)驗(yàn)表明, 溫度為26.93℃時(shí)幼貝生長率最高,通過模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)此溫度下幼貝生長率達(dá)到了42.30%, 與以上研究結(jié)果基本吻合。運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行分析, 擬合得到的生長率的二次響應(yīng)面回歸方程,軟件模擬分析后, 波紋巴非蛤幼貝最適生長環(huán)境組合是溫度為26.93℃、鹽度為31.39、密度為1.12 個(gè)/cm2,理論最佳生長率為 41.47%, 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后, 得到的生長率為 42.30%, 與理論值相近, 證實(shí)了響應(yīng)面模型能較好地優(yōu)化波紋巴非蛤幼貝的生長條件。

4 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法研究了溫度、鹽度和密度三者交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長的影響, 取得了以下結(jié)論: (1)鹽度因子對波紋巴非蛤幼貝生長至關(guān)重要, 適宜的鹽度和溫度對幼貝生長有極大地促進(jìn)作用, 在實(shí)際養(yǎng)殖過程中要注意二者聯(lián)合效應(yīng)。(2)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果十分接近, 響應(yīng)面法不僅減少多因素交互實(shí)驗(yàn)次數(shù), 同時(shí)可靠地反應(yīng)出各研究因子對幼貝生長的影響程度, 準(zhǔn)確地預(yù)測了實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 此方法在明確了影響因子的前提下,對分析多因子影響實(shí)驗(yàn)效果較好。

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