黃可君，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門(mén)361021）

乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1，ADHs）分布廣泛，目前從多種生物中均可分離得到［1］.來(lái)源于微生物的乙醇脫氫酶吸引了更多研究者關(guān)注，這是由于它能用于合成或修飾一些高價(jià)值的醇類(lèi)物質(zhì)，尤其是一些手性醇類(lèi)物質(zhì)［2-3］.乙醇脫氫酶能參與體內(nèi)的乙醇代謝，但是當(dāng)攝入過(guò)多乙醇的時(shí)候，將大量消耗NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）生產(chǎn)NADH，導(dǎo)致肝臟甘油三磷酸酯的積累并抑制檸檬酸循環(huán)，最終導(dǎo)致代謝紊亂［4］.近年來(lái)，關(guān)于乙醇脫氫酶的研究越來(lái)越深入，ADH正在更加廣泛的應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療以及科研中［5］.ADH主要以同型或異形二聚體的形式存在，有研究表明部分乙醇脫氫酶甚至有由二聚體聚合成為的更加復(fù)雜的四聚體結(jié)構(gòu)［4］.在人體中，乙醇脫氫酶可將底物氧化為醛，是一個(gè)氧化過(guò)程，而植物和細(xì)菌中的這一過(guò)程則恰好相反，其ADH催化的則是一個(gè)還原反應(yīng)［4］.分子對(duì)接對(duì)研究高級(jí)結(jié)構(gòu)尚不明晰蛋白質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理具有明顯優(yōu)勢(shì).有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，通過(guò)同源建模所得三維結(jié)構(gòu)，在木聚糖與底物可能結(jié)合的活性口袋部分以計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接，可預(yù)測(cè)酶促反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵氨基酸殘基［6］.如蓋偉等［7］利用Autodock程序篩選復(fù)方丹參方中HMG-CoA還原酶的抑制性成分；章媛等［8］利用分子對(duì)接與同源建模的方法對(duì)設(shè)計(jì)的化學(xué)藥物進(jìn)行打分，這也是一種典型的利用分子模擬對(duì)接完成的藥物開(kāi)發(fā)環(huán)節(jié).分子對(duì)接的結(jié)果對(duì)酶的定向改造及抑制劑開(kāi)放均具有重要意義.基于此，本文通過(guò)分子對(duì)接的方法探尋其催化底物脫氫時(shí)酶與底物分子的特定位點(diǎn)間存在作用力及其與底物親和力之間的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

使用的ADH源自Sulfolobussolfataricus，是一種極端嗜熱古菌［9］，屬雙亞基蛋白，每個(gè)單體具有一個(gè)酶蛋白、一個(gè)輔酶分子（NAD），以及兩個(gè)鋅離子.其中：兩個(gè)鋅離子功能不同，Zn400僅屬于結(jié)構(gòu)原子，Zn500則位于活性位點(diǎn)，對(duì)催化活性和對(duì)接結(jié)果具有顯著影響.相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在0.1mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液 （pH＝10.5，65℃）的條件下測(cè)定的［10］.

小分子一般沒(méi)有現(xiàn)成的PDB文件，所以文中底物分子的原始數(shù)據(jù)源自NCBI的Pubchem，并需要通過(guò)PRODRG2Server，轉(zhuǎn)為為PDB文件（http：∥davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg／）.圖1為選用的15種底物小分子結(jié)構(gòu)，表1為其相應(yīng)的催化能力參數(shù)［10］.表1中：Km為抗體與底物結(jié)合的解離平衡常數(shù)（米氏常數(shù)）；Kcat為抗體酶存在時(shí)的轉(zhuǎn)換速率；CID為化合物的編號(hào).

圖1 15種底物分子的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the 15substrates

表1 對(duì)不同底物催化能力參數(shù)表Tab.1 Catalytic capacity parameters with all substrates

1.2 模擬方法

采用的分子對(duì)接方式：a）單亞基酶蛋白與底物分子對(duì)接；b）單亞基酶蛋白+輔酶與底物對(duì)接；c）單亞基酶蛋白+輔酶+鋅離子（位于活性位點(diǎn)的Zn500）與底物進(jìn)行對(duì)接.由于要進(jìn)行Gasteiger加電計(jì)算，要求小分子底物必須提前做過(guò)能量最小化且加上所有氫.此過(guò)程可在PRODRG2Server生成pdb文件時(shí)完成.在對(duì)接條件的選擇中，將蛋白質(zhì)分子作為剛性分子考慮，并且不合并非極性氫.由于所下載的PDB文件本身就帶有輔酶NAD及底物，故可通過(guò)計(jì)算PDB文件中底物分子的中心來(lái)估算活性位點(diǎn)的坐標(biāo).

GridBox的設(shè)定將明顯影響到分子的對(duì)接效果，故設(shè)定的GridBox需遵守以下的2個(gè)原則：1）確?；钚晕稽c(diǎn)周邊基團(tuán)都能納入GridBox，這是底物正確對(duì)接的基本保證；2）設(shè)定盡可能小的GridBox，有效對(duì)接的比例將大大增加.在保持模擬次數(shù)不變的條件下，有效對(duì)接次數(shù)的增加將使最佳對(duì)接模型更接近實(shí)際情況.綜合考慮底物分子中心及分子口袋位置，選?。?0.389，16.766，15.254）作為中心點(diǎn).其中：X，Y，Z軸的長(zhǎng)度單位分別取40，42，40，晶格大小定義為3.75×10-11m.使用的軟件為Autodock 4.2小分子三維建模軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 輔酶對(duì)分子對(duì)接結(jié)果的影響

當(dāng)僅使用酶蛋白與底物進(jìn)行對(duì)接的時(shí)候，底物分子被對(duì)接在原來(lái)酶蛋白與NAD相作用的位點(diǎn)，如圖2所示.由此可以推斷后者的對(duì)接是沒(méi)有意義的 .小分子與酶蛋白的對(duì)接結(jié)果，如圖3所示 .圖3中：E為分子勢(shì)能 .對(duì)比圖3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：對(duì)接結(jié)果所得的各參數(shù)與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的Km值沒(méi)有相關(guān)性，其r值僅為0.13，而p值為0.63，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于所要求的小于0.05的值.

圖2 小分子與酶蛋白的錯(cuò)誤對(duì)接Fig.2 Error docking result of the substrates with zymoprotein

實(shí)驗(yàn)解析出的底物分子、輔酶和鋅離子緊緊相鄰而互不重疊，它們共同位于分子最大的一個(gè)溝，輔酶恰好填補(bǔ)了溝內(nèi)的深處空間，而鋅離子附近則位于酶的活性位點(diǎn)附近.輔酶存在時(shí)，小分子能正確地對(duì)接在靠近口袋出口的地方；而缺少NAD時(shí)，小分子則向口袋縱深漂移（圖2）.

2.2 鋅離子對(duì)分子對(duì)接結(jié)果的影響

Zn離子并不會(huì)通過(guò)占據(jù)空間的方式阻止地位結(jié)合到錯(cuò)誤的位點(diǎn)，相反，它起到了一個(gè)吸引的作用，能降低底物分子漂出活性口袋的概率.圖4為小分子與全酶的對(duì)接結(jié)果，表2為不同對(duì)接方式的r值.從圖3，4和表2的對(duì)接結(jié)果可以看出：帶有鋅離子的全酶比不帶有鋅離子的酶的對(duì)接結(jié)果與實(shí)驗(yàn)值具有更高的相關(guān)性.Hu等［11］研究也顯示，鋅離子在總的結(jié)合能中貢獻(xiàn)了相當(dāng)大的一部分.這就解釋了為什么沒(méi)有鋅離子的時(shí)候也能正確對(duì)接，而對(duì)接位點(diǎn)的專(zhuān)一性會(huì)下降.鋅離子能夠起到一個(gè)穩(wěn)定體系的作用，具體表現(xiàn)為當(dāng)缺少鋅離子的時(shí)候，對(duì)接結(jié)果的RMSD值顯著上升［12］.

圖3 小分子與酶蛋白的對(duì)接結(jié)果Fig.3 Docking result of the substrates with zymoprotein

圖4 小分子與全酶的對(duì)接結(jié)果 Fig.4 Docking result of the substrates with holoenzyme

由于Autodock默認(rèn)將均方根偏差（RMSD）值相差在2以?xún)?nèi)的對(duì)接結(jié)果歸于同一組，RMSD值的上升將導(dǎo)致對(duì)接結(jié)果的分組明顯增多.因此從對(duì)接結(jié)果來(lái)看，其分組數(shù)目與RMSD值一樣，都是體現(xiàn)體系穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo).對(duì)接的結(jié)果表明該乙醇脫氫酶是鋅離子依賴(lài)性的，這與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果是一致的［13］.引入NAD及Zn以后，數(shù)據(jù)的相關(guān)性就大大增強(qiáng)了，r值為0.63，p值為0.01，模型達(dá)到極顯著相關(guān)性 .此外，RMSD值的變化也趨于變小，表現(xiàn)為分組變少或?qū)咏Y(jié)果更加集中于第一組，證明體系的穩(wěn)定性是因?yàn)橐胼o酶和輔基而顯著增強(qiáng)的.

表2 不同對(duì)接方式的r值Tab.2 r-value of different docking ways

圖5為正確的分子對(duì)接結(jié)果.圖5顯示了底物分子，NAD和Zn三者的相對(duì)位置，是通過(guò)實(shí)驗(yàn)解析所得出的空間關(guān)系.為了更清晰地顯示小分子，NAD和Zn，以不同的顯示方式來(lái)表示不同分子.從圖5可以發(fā)現(xiàn)：底物分子，NAD和Zn三者都被包埋在分子的同一深溝，底物分子位于此深溝的最外區(qū).

圖5 小分子與全酶的相對(duì)位置Fig.5 Relative position of the substrates with holoenzyme

從以上數(shù)據(jù)可以得出如下3點(diǎn)結(jié)論：1）底物與酶進(jìn)行對(duì)接的過(guò)程中，輔酶和金屬離子對(duì)于酶活性的保持是不可或缺的，它們的存在與否大大影響到對(duì)接的可靠性；2）當(dāng)只使用酶蛋白與底物進(jìn)行分子對(duì)接的時(shí)候，所得數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)值無(wú)任何相關(guān)性；3）與酶蛋白對(duì)接的在原始數(shù)據(jù)中，各獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的RSMD值變化很大，證明對(duì)接的專(zhuān)一性很差.有文獻(xiàn)表明［4］，小分子沒(méi)有直接同酶蛋白相互作用，而是與酶-金屬離子復(fù)合體相互作用，對(duì)接所得的數(shù)據(jù)恰恰佐證了這一點(diǎn).從圖3，4和表2的R值可以看出：當(dāng)NAD和Zn同時(shí)存在的時(shí)候，數(shù)據(jù)的相關(guān)性更強(qiáng).

2.3 其他因素對(duì)分子對(duì)接結(jié)果的影響

經(jīng)過(guò)對(duì)對(duì)接結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)單個(gè)氫鍵的鍵能、鍵長(zhǎng)并不會(huì)對(duì)對(duì)接結(jié)果的打分造成明顯影響.所有有效的對(duì)接結(jié)果中均存在相同的氫鍵（由第40位的Ser（絲氨酸）與底物分子中的氧原子形成）.然而，錯(cuò)誤的對(duì)接結(jié)果則可能含有更多的氫鍵（3～4個(gè)氫鍵），這表明氫鍵的數(shù)量對(duì)分子的結(jié)合有明顯的影響，氫鍵越多，分子間結(jié)合越穩(wěn)定.只有形成有效的氫鍵才是正確的對(duì)接結(jié)果，且只有正確的空間位置才能保證酶的催化活性.除了位點(diǎn)空間位的互補(bǔ)、靜電相互作用和氫鍵以外，溶解熵也對(duì)穩(wěn)定受體-配體復(fù)合物起著重要的作用［14］.

需要注意的是，對(duì)接時(shí)虛擬的環(huán)境與實(shí)驗(yàn)的測(cè)定環(huán)境不同，目前的對(duì)接程序尚無(wú)法提供具體的離子強(qiáng)度、溫度等參數(shù)的設(shè)定.實(shí)際試驗(yàn)中，體系的離子強(qiáng)度、離子種類(lèi)以及溫度都能影響到酶與底物的結(jié)合情況.例如，Sulfolobussolfataricus是一種超高溫菌［9］，故實(shí)驗(yàn)使用的數(shù)據(jù)是在0.1mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液（pH＝10.5，65℃）的條件下測(cè)定的［10］.Autodock對(duì)條件進(jìn)行了簡(jiǎn)化和近似處理，在計(jì)算能量時(shí)將體系溫度設(shè)定為298.15K（25℃），而pH值及離子強(qiáng)度和種類(lèi)也難以設(shè)定.有文獻(xiàn)顯示，溫度，pH值和金屬離子對(duì)乙醇脫氫酶的活性均有顯著影響［15］.綜上所述，這樣的條件差別會(huì)明顯影響到分子對(duì)接的準(zhǔn)確性及其與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Km的相關(guān)性.

3 討論

分子對(duì)接結(jié)果能提供一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的參考，但當(dāng)前的分子對(duì)接選算法不可能替代傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn).雖然分子對(duì)接的結(jié)果并不能十分精確反應(yīng)底物與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果，分子結(jié)合力的強(qiáng)弱也不能完全反映酶活性的大?。ㄟ^(guò)高的結(jié)合力將使得酶促反應(yīng)的效果變差）［16］.但值得一提的是，分子對(duì)接的結(jié)果具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（結(jié)合力弱的一定不會(huì)是最佳底物），如果利用其結(jié)果進(jìn)行初步篩選，將會(huì)極大節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本.Richard［17］曾經(jīng)把350萬(wàn)臺(tái)個(gè)人計(jì)算機(jī)連接起來(lái)，在幾天內(nèi)從數(shù)十億的類(lèi)藥分子庫(kù)里篩選出目標(biāo)蛋白質(zhì)的配體，而篩選出的數(shù)百個(gè)小分子經(jīng)測(cè)試約10%的小分子有活性.

對(duì)接結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)的酶蛋白對(duì)接結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明了酶蛋白失去輔酶后確實(shí)不具有生物學(xué)活性.輔酶對(duì)于酶分子的活性具有至關(guān)重要的作用，對(duì)于乙醇脫氫酶來(lái)說(shuō)，底物是同酶蛋白-輔酶復(fù)合體相互作用完成酶促反應(yīng)的.鋅離子則能夠給起到一個(gè)穩(wěn)定體系的作用，缺乏鋅離子將引發(fā)酶活性的降低.當(dāng)然，文中分子對(duì)接環(huán)境與實(shí)驗(yàn)中酶分子所處真實(shí)環(huán)境有所不同，這對(duì)分子對(duì)接結(jié)果與酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)有可能有一定影響.

對(duì)于帶有輔酶或者金屬輔基的分子對(duì)接，欲預(yù)測(cè)某個(gè)特定酶對(duì)底物的生物活性，則必須將輔酶及金屬離子加入到對(duì)接體系中，否則對(duì)接的特異性和有效性將大打折扣，不能取得有參考意義的結(jié)果.對(duì)于不知道結(jié)合位點(diǎn)的盲目對(duì)接（blind docking）來(lái)說(shuō)，金屬離子和輔酶的意義就更為重要了.底物分子與酶的對(duì)接結(jié)果并不能完全反映酶對(duì)底物的活性，因?yàn)槊富钚圆粌H涉及底物與酶的結(jié)合，還涉及產(chǎn)物的離開(kāi)，并且分子對(duì)接的過(guò)程中其理化參數(shù)會(huì)與生理狀態(tài)下有所不同.雖然分子對(duì)接的結(jié)果只能提供一個(gè)相對(duì)粗糙的、趨勢(shì)性的預(yù)測(cè)，但是確實(shí)能夠極大縮減實(shí)際實(shí)驗(yàn)的成本，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)的效率和經(jīng)濟(jì)效益具有非凡的意義.

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