林梅雙，吳曉蔓（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州 510260）

磁珠被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離提純、細(xì)胞分離、酶的固定、免疫分析等多個(gè)領(lǐng)域［1－4］。以磁珠為固相介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純是一項(xiàng)新興的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，與傳統(tǒng)分離方法比較，蛋白質(zhì)的磁分離技術(shù)具有快速、高純、高收率等優(yōu)點(diǎn)［5］。羧基磁珠是表面帶有羧基功能團(tuán)的磁珠，其吸附蛋白是基于磁珠表面的陰離子交換基團(tuán)－COOH與表面帶正電的蛋白之間的作用［6］。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）分子量大，其結(jié)構(gòu)變化對(duì)活性影響較大，結(jié)構(gòu)和活性表征相對(duì)容易研究且手段多［7］，所以本文選擇HBsAg作模型蛋白質(zhì)。研究使用市場上廣泛生產(chǎn)的表面帶有羧基的聚合物磁珠吸附HBsAg的性能，為磁珠在蛋白質(zhì)分離純化中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 血源性HBsAg純品由上海葉民生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 儀器與試劑 羧基磁珠與磁分離架分別由上海奧潤微納新材料科技有限公司和無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司提供，HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒和BCA蛋白質(zhì)定量試劑由沈陽惠明生物工程有限公司和天根生化科技有限公司提供，瑞士TECAN酶標(biāo)儀Infinite M200，以上試劑均在有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 方法

1.3.1 影響磁珠吸附HBsAg的因素 取1mL血源性HB－sAg純品，加入200μL 5mg／mL的磁珠和18μL 1mmol／L氯化鋅，混勻后，在37℃溫箱中放置5min，通過磁場分離磁珠，吸出液體為吸附后溶液。改變磁珠用量、HBsAg原始濃度、吸附溫度、吸附時(shí)間。BCA法測定吸附前、吸附后HBsAg的蛋白含量，計(jì)算吸附量。判斷影響磁珠吸附HBsAg的因素。

1.3.2 HBsAg的洗脫 取某一濃度的血源性HBsAg純品，按上述方法進(jìn)行磁珠吸附后，用10mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 5.0 3次清洗磁珠，加入250μL 10mmol／L 的NaOH溶液，洗脫1min后，通過磁場分離磁珠，吸出液體為洗脫液。BCA法測定吸附前、吸附后和洗脫液的HBsAg蛋白含量，計(jì)算洗脫率。將洗脫液稀釋10萬倍后，ELISA測定洗脫液的稀釋液和不同濃度（2、5、10、15、20、25、30ng／mL）HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品溶液HBsAg的吸光度（A）。通過標(biāo)準(zhǔn)品濃度－A值標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算洗脫液HBsAg的生物活性濃度占BCA法檢測的洗脫液HBsAg濃度的百分比，即為洗脫液中HBsAg的生物活性保留率。

1.3.3 判斷吸附量與洗脫率 按以下公式計(jì)算：

Q＝（C0V0－C1V1）／m

洗脫率（%）＝C2V2／（C0V0－C1V1）×100%

式中：Q 為吸附量（μg／mg）；m 為磁珠的質(zhì)量（mg）；C0、C1、C2分別為吸附前、吸附后和洗脫液的 HBsAg濃度（μg／mL）；V0、V1、V2分別為吸附前、吸附后和洗脫液的體積（mL）。

2 結(jié) 果

2.1 磁珠用量 隨著磁珠用量的增加，吸附的總蛋白逐漸增多，但單位磁珠的吸附量卻減少。見圖1、2。

圖1 磁珠用量對(duì)吸附HBsAg總量的影響

圖2 磁珠用量對(duì)HBsAg吸附率的影響

2.2 HBsAg濃度 磁珠吸附HBsAg的量隨HBsAg初始濃度的增加而增多，在較低濃度范圍（小于200μg／mL）時(shí)，吸附量隨HBsAg濃度的增加而增多趨勢比較明顯；而在較高的濃度范圍（大于200μg／mL），趨勢變緩。見圖3。

圖3 HBsAg濃度對(duì)HBsAg吸附率的影響

圖4 溫度對(duì)吸附HBsAg的影響

2.3 溫度 隨著溫度增高，磁珠吸附HBsAg的能力也增強(qiáng)。見圖4。

2.4 吸附時(shí)間 磁珠吸附在5min時(shí)達(dá)到峰值，但隨著時(shí)間延長能力有所降低，大約在30min時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。見圖5。

2.5 HBsAg的洗脫 磁珠吸附濃度為524.24μg／mL的血源性HBsAg純品后，使用10mmol／L NaOH溶液洗脫HBsAg，洗脫率是71.02%，活性保留率為88.15%。

圖5 吸附時(shí)間對(duì)吸附HBsAg的影響

3 討 論

相對(duì)傳統(tǒng)分離方法，蛋白質(zhì)的磁分離技術(shù)有更多的優(yōu)勢。而表面帶有－COOH功能基團(tuán)在蛋白質(zhì)分離提純中比較常用。

本研究通過磁珠用量、HBsAg濃度、溫度、吸附時(shí)間各方面來探討市場上廣泛生產(chǎn)的帶有羧基的聚合物磁珠吸附HB－sAg的性能。結(jié)果顯示：（1）隨著磁珠用量的增加，吸附 HB－sAg的總蛋白量逐漸增多，但單位磁珠的吸附量卻減少。磁珠用量的增加使有限空間內(nèi)磁珠的總表面積增大，從而促進(jìn)了吸附反應(yīng)進(jìn)行，但同時(shí)也大大降低了單個(gè)磁珠與HBsAg碰撞的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致單個(gè)磁珠吸附 HBsAg的量降低。（2）磁珠吸附HBsAg的量隨HBsAg初始濃度的增加而增多，在較低濃度范圍時(shí)，吸附量隨HBsAg濃度的增加而增多趨勢比較明顯；而在較高的濃度范圍，吸附量隨HBsAg初始濃度的增加而增多的趨勢變緩。隨著HBsAg濃度的增加，磁珠表面所吸附的HBsAg分子也逐漸增加，直至達(dá)到飽和狀態(tài)，此時(shí)雖然再增加HBsAg的初始濃度，但受磁珠表面積的限制，HBsAg的吸附量也不會(huì)發(fā)生太大的變化。（3）隨著溫度增高，磁珠吸附HB－sAg的能力也增強(qiáng)?？赡苁菧囟葧?huì)影響HBsAg分子的布朗運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致HBsAg與磁珠碰撞吸附行為的變化，低溫（4℃）時(shí)，HBsAg吸附率略低，隨溫度升高，HBsAg吸附率逐漸增大。也可能是在pH接近中性的溶液中，磁珠吸附HBsAg的主要驅(qū)動(dòng)力是疏水作用，通常情況下，在一定溫度范圍內(nèi)疏水作用力會(huì)隨溫度升高而增強(qiáng)，導(dǎo)致磁珠吸附HBsAg增強(qiáng)。（4）磁珠吸附在5min時(shí)達(dá)到峰值，但隨著時(shí)間延長能力有所降低，大約在30min時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期。可見磁珠在較短時(shí)間內(nèi)吸附HBsAg達(dá)到飽和，但是隨著時(shí)間延長又慢慢解離，直到進(jìn)入平衡狀態(tài)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羧基磁珠能夠吸附HBsAg，但不穩(wěn)定，易受磁珠用量、HBsAg濃度、溫度、吸附時(shí)間等多因素影響，在實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。

使用10mmol／L NaOH溶液洗脫 HBsAg的洗脫率是71.02%，活性保留率為88.15%。在一定pH條件下，羧基磁珠帶負(fù)電會(huì)與帶正電的基團(tuán)在二價(jià)離子的作用下，發(fā)生共價(jià)結(jié)合，改變pH值會(huì)使結(jié)合上去的物質(zhì)釋放下來，因此被吸附在磁珠上的HBsAg可以通過NaOH溶液洗脫下來。實(shí)驗(yàn)證實(shí)磁珠吸附上的HBsAg不但可以洗脫下來，而且洗脫下來的HBsAg仍具有較好的抗原活性。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果沒有加入二價(jià)離子磁珠是無法吸附蛋白質(zhì)的。至于為何要加入二價(jià)離子，有學(xué)者認(rèn)為磁珠與二價(jià)金屬溶液充分接觸后，形成表面螯合二價(jià)離子的磁性金屬親和載體，可選擇性吸附含組氨酸殘基的蛋白質(zhì)［8］。本次研究運(yùn)用市場上廣泛生產(chǎn)的帶有羧基的磁珠吸附血源性純HBsAg，探討磁珠吸附HB－sAg的性能，確定磁珠吸附蛋白質(zhì)的機(jī)制，為磁珠吸附其他蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

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