鄭傳浩，姚 磊，李 毅（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院檢驗科，重慶 400037）

相對定量法廣泛應(yīng)用于實時反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）中，然而PCR產(chǎn)物的準確定量需要可用于數(shù)據(jù)分析的數(shù)學(xué)模型，目前2（－ΔΔCT）方法已經(jīng)常規(guī)運用于實時 RT－PCR的相對定量分析，但是它沒考慮PCR過程中的各種影響因素［1－5］。本文介紹了一種簡便、準確的基因表達相對定量實時RT－PCR的GenEx軟件分析方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 HK－2細胞系（本實驗室提供）、3例健康者和3例乙型肝炎患者血清（已向患者交代血清的用途，并征求了患者的同意）。

1.2 方 法

1.2.1 最優(yōu)PCR退火溫度的選擇 以HK－2細胞cDNA為模板，利用銳博生物購買的miR－16的PCR引物，按照TaKaRa TaqTM（DR001A）試劑說明書配制反應(yīng)體系，分別設(shè)定4個重復(fù)管，進行退火溫度為62℃、59℃、55℃、53℃的PCR反應(yīng)，各反應(yīng)溫度設(shè)定2個重復(fù)管。然后通過20g／L瓊脂糖凝膠電泳評價最適退火溫度。

1.2.2 實時熒光PCR采用SYBR premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Takara DRR420）試劑盒和相應(yīng)miRNA引物（銳博生物提供）。20μL反應(yīng)體系中含SYBR Green Mix 10 μL、cDNA 2μL、miRNA、Bulge－LoopTMmiRNA Forward Primer（銳博生物提供，62.5nmol／L）0.8μL 、Bulge－LoopTMmiRNA Reverse Primer（銳博生物提供，62.5nmol／L）0.8μL 、RNase－free H2O 6μL。在ABI StepOne儀器上按照如下順序進行反應(yīng)：95℃預(yù)變性2min，95℃變性10s，以得到的最優(yōu)退火溫度反應(yīng)30s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后立即行融解曲線分析，檢測溫度為70～95℃，升溫速率為0.4℃／次，恒溫時間為1分鐘／次。

1.2.3 計算擴增效率 以10倍系列稀釋的 HK－2細胞cDNA為模板，進行熒光定量PCR檢測。由對數(shù)濃度值為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線。通過公式E＝10（－1／s）分別計算出miR－16和miR－122的擴增效率。式中E代表擴增效率，S代表標準曲線的斜率。

1.2.4 RNA的提取 收集3例健康者和3例乙型肝炎患者血清各1mL，將其分為500μL的2管，然后按照Trizol LS（Invitrigen）說明書操作，提取血清總RNA。

1.2.5 cDNA的合成 在無核酸酶污染的EP管中加入RNA 2μL，逆轉(zhuǎn)錄引物（銳博生物提供）1μL，按 M－MLV（Promega）的說明書操作合成cDNA。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實驗分別采用GenEx軟件分析和2（－ΔΔCT）計算兩種方法來進行miRNA相對定量分析。GenEx軟件可通過http：／／www.qpcrforum.com／下載，將內(nèi)參基因和目的基因的擴增效率和測定得到的Ct值輸入該軟件中，按軟件說明進行操作，然后得到表達比值及統(tǒng)計分析結(jié)果。2（－ΔΔCT）分析是按照文獻［2］提供的公式進行相應(yīng)的計算。

2 結(jié) 果

2.1 最優(yōu)PCR退火溫度的選擇 以HK－2細胞cDNA為模板，分別以退火溫度為62℃、59℃、55℃、53℃來進行PCR。20g／L瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，退火溫度為55℃時，PCR擴增后的產(chǎn)量最多，圖1。

圖1 HK－2細胞系cDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。

2.2 擴增效率的計算 以10倍系列稀釋的HK－2細胞cDNA為模板，進行熒光定量PCR檢測。由對數(shù)濃度值為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線。由圖2可知，miR－16的斜率為－3.449，miR－122的斜率為－3.304，通過公式 E＝10（－1／s）可計算出 EmiR－16＝0.97，EmiR－122＝1.1。

圖2 HK－2細胞cDNA經(jīng)過熒光定量PCR后所得的擴增曲線及根據(jù)所得的Ct值繪制標準曲線。

2.3 miR－122基因相對定量分析

2.3.1 GenEx軟件相對定量分析 按照實驗分組，將相應(yīng)的Ct值（表1）導(dǎo)入GenEx軟件中，進行數(shù)據(jù)的預(yù)處理。把miR－16和miR－122的擴增效率：0.97和1.1的輸入軟件，就可輕松地得到其校正后的Ct值，見表2。設(shè)定miR－16為參考基因，miR－122為目的基因，然后軟件可自動計算重復(fù)測定同血清來源miRNA的均值，然后進行相對定量分析最終得到乙型肝炎患者血清中miR－122的表達量是健康者的54.06倍，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 健康者和乙型肝炎患者qPCR結(jié)果

表2 健康者和乙型肝炎患者的E值校正后數(shù)據(jù)

2.3.2 2（－ΔΔCT）法數(shù)據(jù)分析 將表1的數(shù)據(jù)采用2（－ΔΔCT）法計算后，最終得到乙肝患者血清中miR－122的表達量是正常人群的44.30倍，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

總結(jié)以上實驗數(shù)據(jù)，分別采用2（－ΔΔCT）法及GenEx軟件分析來進行相對定量分析，用2（－ΔΔCT）得出乙型肝炎患者血清中miR－122的表達量是健康者的44.30倍，而采用GenEx軟件分析為54.06倍，可見采用 GenEx分析的比值較2（－ΔΔCT）高。

3 討 論

采用的實時RT－PCR技術(shù)進行基因表達分析包括絕對定量及相對定量法。由于研究者多關(guān)注目的基因的表達變化，即實驗組與對照組的基因表達比值的變化。相對定量已經(jīng)成為基因表達分析最常用的手段。但是目前大多數(shù)相對定量的研究都用于mRNA的水平上，對于 miRNA的研究還很少［6－8］，miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性，在逆轉(zhuǎn)錄的時候變異較小，本實驗著重于miRNA的研究。用兩種數(shù)據(jù)分析方法研究HBV患者血清相對于健康者血清中miR－122相對表達量的改變。

本文將2（－ΔΔCT）法與GenEx軟件分析進行了比較，表明采用2（－ΔΔCT）法計算的表達比值比GenEx軟件分析低10%，最好采用GenEx軟件分析。

目前市場上銷售的熒光定量PCR儀如Stratagene公司、Life Technology公司等多采用的2（－ΔΔCT）相對定量法。因其將PCR的擴增效率設(shè)定為1，但實際的擴增效率不可能達到1，因此該法計算出的相對定量結(jié)果通常不太精確［9］。GenEx軟件是專門設(shè)計用于實時RT－PCR技術(shù)相對定量基因表達分析，其考慮了各方面的因素，因此相對于2（－ΔΔCT）的方法來說具有更高的精確度?？傊?，GenEx軟件分析較2（－ΔΔCT）法更適用于相對定量的數(shù)據(jù)分析。

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