孫海波，王紹清，王琳琳，林 立

(國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京100091)

通過葡萄酒中水分的穩(wěn)定氫氧同位素比檢測法對摻假葡萄酒進行鑒別時，葡萄酒中水分的提取是本技術(shù)的關(guān)鍵點。隨著穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)及其應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展［1-2］，很多抽提技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于樣品的水分提取，包括低溫真空蒸餾［3-4］、共沸蒸餾［5-6］、微蒸餾法(鋅)［7］和沸點蒸餾［2］等。但各種抽提技術(shù)各有不足之處，如采用甲苯、二甲苯及煤油等共沸蒸餾技術(shù)被證實存在同位素分餾現(xiàn)象［8］;鋅的微蒸餾法需要與離線穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀配合，且只能測δD‰;沸點蒸餾和低溫真空蒸餾的應(yīng)用最為廣泛，但針對組成復(fù)雜的葡萄酒(80%左右的水，9.5%～15%的乙醇，1%～5%的各種酚、糖、酸、芳香等有機物)，蒸餾得到的是乙醇和水的混合物，因此上述常規(guī)方法都不完全適用于葡萄酒中水分的提取?；钚蕴拷?jīng)活化處理后，被廣泛應(yīng)用于脫色和有機物的吸附［9-10］，能夠?qū)崿F(xiàn)酒完全脫色，也有文獻證明其對乙醇也有一定的吸附作用［11］，但并不能將乙醇和水完全分離開來。冷凍濃縮［12-13］是一種提高食品(主要葡萄酒、牛奶和果汁)品質(zhì)的工藝技術(shù)，依據(jù)食品的固-液相位分布，在冰和液體兩相共存區(qū)域，將冰分離出來的技術(shù)，冰的分離方法有過濾式離心、壓濾和洗滌等［14］。利用葡萄酒中乙醇和水的熔點差距大(乙醇:-117.3℃，水:0℃)，本研究開發(fā)了冷凍離心與活性炭吸附相結(jié)合的方法(稱冷凍-離心法)，在保證不發(fā)生穩(wěn)定氫氧同位素分餾的前提下，對葡萄酒中水分進行提取。此技術(shù)的開發(fā)，解決了葡萄酒中水分的穩(wěn)定氫氧同位素比檢測技術(shù)的關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒樣 干型，酒精度12%，北京龍徽釀酒有限公司;標準平均海洋水(Standard Mean Ocean Water，SMOW) 同位素比值為 δD‰=0;δ18O‰=0;酸性活性炭［15］稱取粉狀活性炭(化學(xué)純，80～200目)約200g，加入1L體積分數(shù)為10%的鹽酸，加熱至沸騰，真空過濾，取下結(jié)塊于一個大燒杯中，用水清洗至濾液中無鐵離子為止，在110～120℃烘箱中干燥約10h后使用;乙醇水系列標準溶液的配制 分別移取無水乙醇 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL 于 10mL 的容量瓶中，加實驗室純凈水定容后搖勻備用;乙醇水模擬溶液配制 量取無水乙醇100mL于1000mL的容量瓶中，加實驗室純凈水定容后搖勻備用。

Hydra20-20 HTF/EA穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀英國sercon;7890A氣相色譜儀 美國Agilent;Rotofix32A離心機;海爾冰箱(BCD-252KBSL)。

1.2 實驗方法

取葡萄酒樣品或10%的乙醇水溶液10mL于塑料小瓶中，蓋蓋擰緊后置于-18℃的冰箱中冷凍8h以上，取出后立即倒置于離心機中進行過濾式離心，離心半徑5cm，4000r/min離心3min，取上層冰置于室溫，待冰融化后，加入0.5g活性炭，搖勻，靜置一段時間后，取上層清液過0.45μm水相微孔濾膜于色譜瓶中待測。

為考察活性炭吸附和冷凍離心分離水分提取方法對水分提取效率和葡萄酒中水分的氫氧穩(wěn)定同位素檢測結(jié)果的影響，設(shè)計如下多級冷凍離心與活性炭吸附結(jié)合水分提取實驗，實驗設(shè)計示意見圖1，經(jīng)活性炭脫色的葡萄酒樣品冷凍離心后得到的上層冰標記為樣品U，下層溶液標記為樣品D;用U和D的下標數(shù)字表示離心次數(shù)，取每一步的上層冰U和下層溶液D進行氫氧穩(wěn)定同位素比率和總碳含量的檢測，由于D12溶液在-18℃不能結(jié)冰，從而未能得到下層溶液冷凍離心二次以后的數(shù)據(jù)。

圖1 葡萄酒樣水分分離效果檢驗實驗設(shè)計圖Fig.1 Wine sample moisture separation effect test design of experiments

1.3 檢測方法

1.3.1 氫穩(wěn)定同位素的測定 使用HTF-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，載氣流速90mL/min，色譜柱溫度90℃，HTF爐溫1350℃，進樣量0.5μL，待設(shè)備穩(wěn)定，每個目標樣品重復(fù)測試5遍，測定結(jié)果由標準平均海洋水(SMOW)校正，取后三遍結(jié)果的平均值。

1.3.2 氧穩(wěn)定同位素的測定 使用HTF-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，載氣流速90mL/min，色譜柱溫度60℃，HTF 爐溫 1350℃，進樣量 0.2μL，其他步驟同上。

1.3.3 乙醇去除率的測定 使用氣相色譜儀(GC)，在測試樣品序列的首尾分別檢測2%、5%、10%、15%和20%系列乙醇水標準曲線，通過檢測目標樣品的信號強度計算其乙醇體積百分含量，再通過對比水分提取處理前后目標樣品的乙醇的體積百分含量，計算目標樣品水分提取過程的乙醇去除率。

1.3.4 總碳去除率的測定 使用EA-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，載氣流速60mL/min，色譜柱溫度100℃，EA氧化柱1000℃，還原柱600℃，待設(shè)備穩(wěn)定，吸取20μL樣品于加有硅吸附劑的錫杯中，包裹成小球立即進樣(放置時間不超過10min)，測定目標樣品的含碳量，通過對比水分提取處理前后目標樣品的總含碳量，計算目標樣品水分提取過程的總碳去除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性炭吸附和冷凍離心水分提取方法比較

2.1.1 活性炭吸附 實驗考察了活性炭的用量和吸附時間對水分提取的影響，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，無論增加活性炭的用量，還是延長吸附時間，葡萄酒中的色素及其他有機物的脫除效果明顯，而乙醇的去除率都很低。所以無法僅僅通過活性炭吸附實現(xiàn)葡萄酒中的水分提取以用于穩(wěn)定氫氧同位素比的測定。

表1 活性炭吸附時間和濃度對吸附效率的影響Table 1 Fiber activity of carbon adsorption time and concentration on adsorption efficiency

2.1.2 冷凍離心 分別考察了冷凍后樣品平衡時間和離心時間對樣品的乙醇去除率和總C去除率的影響，結(jié)果見表2和表3。如表2所示，在-18℃的冰箱中冷凍12h以上后，樣品置于-5℃的冰箱中平衡5h雖然乙醇去除率略有增加，但水分的提取率卻降低了一倍，因此樣品應(yīng)該在-18℃的冰箱中冷凍后直接進行離心以提取其中的水分。從表3的結(jié)果可以看出，離心時間為3min，葡萄酒和10%乙醇水經(jīng)冷凍離心提取后的乙醇和總碳去除率最高，理論上離心時間越長分離越徹底，但離心時間過長造成冰的融化程度增加，從而減小乙醇的去除率。另外葡萄酒經(jīng)冷凍離心提取后總碳去除率明顯低于乙醇去除率，表明葡萄酒樣品中的色素和其他有機物經(jīng)冷凍離心分離后的去除率偏低。

表2 平衡時間對分離效率的影響Table 2 Effect of equilibration time on separation efficiency

表3 離心時間對分離效率的影響Table 3 Effect of centrifugation time on separation efficiency

2.2 冷凍－離心法條件優(yōu)化

依據(jù)方法中系統(tǒng)實驗設(shè)計，每一級經(jīng)冷凍離心樣品的乙醇百分含量結(jié)果見圖2，穩(wěn)定氫同位素比率值見圖3。結(jié)果表明:冷凍離心一次就能使乙醇在上層(冰)和下層溶液中發(fā)生有效的重新分配，冷凍離心兩次，上層冰中的乙醇的含量已趨近于零，而且下層溶液中的乙醇明顯富集;冷凍離心U(冰)和D溶液的穩(wěn)定同位素δD‰檢測結(jié)果發(fā)生明顯分離，且U(冰)離心2次以后的檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，這說明冷凍離心2次以上提取的水樣可以代表葡萄酒樣品用于氫氧穩(wěn)定同位素比率的測定。

表4 活性炭吸附和冷凍-離心分離方法對穩(wěn)定同位素檢測結(jié)果的影響Table 4 Carbon adsorption and freezing-centrifugal separation method for stable isotope detection result influence

圖2 冷凍離心次數(shù)對分離效率的影響Fig.2 Frozen centrifugation times on the separation efficiency effect

圖3 冷凍離心次數(shù)對穩(wěn)定氫同位素檢測的影響Fig.3 Frozen centrifugation times on the stable isotope detection effect

2.3 冷凍－離心法提取葡萄酒樣品中水分有效性的驗證

用實驗室配制的10%乙醇水溶液進行冷凍-離心和活性炭吸附實驗，實驗前后樣品的穩(wěn)定氫氧同位素比的測定結(jié)果和乙醇的百分含量見表4，依據(jù)乙醇和水的穩(wěn)定氫氧同位素比值與乙醇的百分含量的測定結(jié)果，通過計算得到10%乙醇水溶液及其經(jīng)水分提取后氫氧穩(wěn)定同位素的理論計算結(jié)果也示于表4。從實驗結(jié)果看，理論計算結(jié)果與實驗檢測結(jié)果在偏差范圍內(nèi)均一一對應(yīng)。這說明:冷凍-離心和活性炭吸附相結(jié)合的實驗方法在分離過程沒有引起水的δD‰和δ18O‰穩(wěn)定同位素分餾和水與乙醇中δD‰和δ18O‰的重新分配，能夠?qū)崿F(xiàn)葡萄酒樣品中水分的有效提取。

3 結(jié)論

通過系統(tǒng)實驗設(shè)計優(yōu)化了冷凍-離心分離法實驗條件，實現(xiàn)了葡萄酒中水分的有效提取，葡萄酒經(jīng)提取后的水樣中，乙醇和色素等其他有機物的去除率大于99%，且冷凍-離心分離和活性炭吸附方法均未引起葡萄酒中水分的δD‰和δ18O‰分餾。

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