王伯川，金 剛，劉春明，凌云輝，石 巖，張 本，張紹軒* (.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 00;.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 00;.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 00;.吉林省中醫(yī)藥研究院，吉林長(zhǎng)春 00)

委陵菜(Potentilla chinesis)為薔薇科委陵菜屬植物，具有清熱解毒、涼血止痢之功能［1］。由于療效確切，在《中國(guó)藥典》歷版中均被收載［2］。該屬植物較多，僅吉林省境內(nèi)就有10種之多。由于它們的親緣關(guān)系接近，在同一生境內(nèi)或不同生境內(nèi)生長(zhǎng)的各個(gè)物種間從外觀上很難區(qū)別，加之所含化學(xué)成分接近，因而，用傳統(tǒng)的外觀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別很難達(dá)到滿意效果［3］，導(dǎo)致誤采、誤用，影響療效。為此，本研究采用trnL-F序列分析，對(duì)吉林省地產(chǎn)委陵菜屬植物進(jìn)行鑒別，以彌補(bǔ)上述方法的不足。

1 材料與方法

1.1 樣品

委陵菜伏委陵菜，小叉葉委陵菜，霉葉委陵菜，蔓委陵菜為硅膠快速干燥的葉片。分別集于長(zhǎng)吉高速公路和長(zhǎng)春南湖公園處。均由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)鄧明魯教授鑒定(見表1)。

表1 樣品的采集地點(diǎn)和時(shí)間

1.2 DNA提取

稱取0.3 g各樣品葉片，置于培養(yǎng)皿中，加水少許，浸泡至充分展開，剪去病斑，用棉球擦拭葉片，去除雜質(zhì)，再用70%乙醇擦拭葉片表面，然后用超純水清洗3次，置于超凈臺(tái)上干燥;在液氮中研磨成細(xì)粉，然后按說明用北京鼎國(guó)植物基因組DNA提取試劑盒提取其總 DNA，溶于適量的超純水中。取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量和數(shù)量。

1.3 引物設(shè)計(jì)

選擇trnL通用引物［4］，由寶生物(中國(guó) 大連)合成，其序列如下:

PCR引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

測(cè)序用引物:

trnLF-cF:5'-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3'

trnLF-dR:5'-GAC TCG ATG GTT CAC GGG ATT CT-3'

trnLK-eF:5'-TCT CGC ATC GAT GAA GAA CG-3'

trnLK-fR:5'-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3'

1.4 DNA擴(kuò)增

擴(kuò)增采用50 μL 體系，其中1.3 引物各1 μL，模板各 5 μL，10 × Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，Taq DNA 多聚酶1 μL，超純凈水32 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min。94 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72℃ 2 min，循環(huán)35次。72℃延長(zhǎng)循環(huán)10 min，4℃保存。

1.5 測(cè)序

1.4 PCR產(chǎn)物經(jīng)Montage PCR Filter Units(Millipore Corporation，U.S.A.)純化后，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)采用10 μL體系，用 ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，U.S.A.)測(cè)序，其中含 5 ×sequencing buffer 2.0 μL BigDye(3.1)0.5 μL，純化模板 1.0 μL，1.3 引物 1.0 μL，純凈水5.5 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 96℃ 1 min。96℃30 sec，50℃ 5 sec，循環(huán)25次。60℃ 延長(zhǎng)4 min。

1.6 序列分析

采用網(wǎng)頁http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html和Genetyx-SV/RC version 11.0(Software Development Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)進(jìn)行序列的比對(duì)和編輯。

2 結(jié)果

5種委陵菜trnL-F序列比較見圖1。

圖1 5種委陵菜trnL序列比較

3 討論

除委陵菜外，其他種的trnL-F序列都是首次報(bào)道。如圖1所示，委陵菜各種間trnL-F序列差異明顯，故trnL-F序列分析及其衍生的方法可以用于鑒別委陵菜。委陵菜種類繁多，僅吉林省內(nèi)就有十余種之多，所以本研究?jī)H僅是一個(gè)開始，在今后的研究中需要擴(kuò)大研究樣本的種類，蓄積更多的資料，只有這樣才能更準(zhǔn)確地對(duì)委陵菜各種間進(jìn)行鑒別。

［1］趙 川，喬 衛(wèi)，張彥文，等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(6):680-682.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.2010版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:199.

［3］楊 婷，孫海峰，曹思思，等.10種委陵菜生藥學(xué)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(12):3039-3041.

［4］Taberlet P，Gielly L，Pautou G，et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA［J］.Plant Mol Biol，1991，17(5):1105-1109.