張益萌，楊瀚毅，寧佳怡，閆小龍，韓 靜

0 引言

作為成人最常見的眼內(nèi)腫瘤，脈絡(luò)膜黑色素瘤(choroidal melanoma, CM)的發(fā)病率僅低于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，是位居眼內(nèi)腫瘤發(fā)病率第二位的惡性腫瘤[1]。CM病情復(fù)雜，惡性程度高，預(yù)后極差，易通過(guò)血行轉(zhuǎn)移累及肝臟，由于缺乏特異的治療手段，導(dǎo)致患者的長(zhǎng)期生存率較低[2-4]。目前臨床上針對(duì)CM患者的主要治療手段包括激光療法、放射治療、眼球摘除術(shù)等[4-5]。值得指出的是，出于降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移率和提高患者生存率等方面的考慮，過(guò)去對(duì)CM的治療常采用眼球摘除術(shù)，但并未明顯降低CM轉(zhuǎn)移率以及患者生存率[6-8]，并且其作為一種破壞性手術(shù)，給患者帶來(lái)了極大的身心影響。因此，在保留眼球和視力的前提下，探尋有效提高CM患者生存率，且無(wú)創(chuàng)傷的治療方法成為了目前亟需解決的問(wèn)題。組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)是一種酰胺水解酶，通過(guò)調(diào)控組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的乙?；腿ヒ阴；瘎?dòng)態(tài)平衡參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中HDAC過(guò)度激活，使組蛋白去乙?；鰪?qiáng)，在腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖和分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。因此，HDAC成為了研究抗癌藥物的重要靶點(diǎn)。HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitors, HDACi)通過(guò)改變組蛋白和非組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、分化、抑制細(xì)胞增殖，從而表現(xiàn)出抗癌活性[11-15]。作為HDACi的重要代表之一，辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)已經(jīng)在臨床用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤[10]。同時(shí)，研究表明SAHA在多種腫瘤模型中都能夠通過(guò)單一或聯(lián)合用藥發(fā)揮有效的抗腫瘤作用[11]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18(fibroblast growth factor 18，F(xiàn)GF18)參與了細(xì)胞分化，血管形成，關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，同時(shí)已有證據(jù)表明，F(xiàn)GF18在腫瘤細(xì)胞增殖以及促遷移和侵襲能力方面發(fā)揮重要作用[16]。本研究旨在探討SAHA對(duì)CM細(xì)胞系C918細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)FGF18的調(diào)控作用，進(jìn)一步闡明CM的發(fā)病機(jī)制，并為SAHA治療CM提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng)C918細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10U/mL青、鏈霉素雙抗的DMEM高糖(Corning, USA)培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(細(xì)胞增殖至85%左右)，棄舊培養(yǎng)基，PBS涮洗3遍，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

1.1.2主要試劑脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞系C918購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；青鏈霉素購(gòu)自上海格來(lái)賽生命科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biond Biologics公司；β-actin單克隆抗體、c-Myc抗體、CDK2抗體、CyclinA2抗體和FGF18抗體購(gòu)自CST公司；SAHA購(gòu)自MedChemExpress(Monmouth Junction, NJ, USA)；BeyoClickTMEdU-594試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自上海七星復(fù)泰生物科技有限公司；DMSO購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將C918細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、SAHA 0.625、1.25、2.5μmol/L組。觀察細(xì)胞的貼壁率及細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞貼壁后按照藥物梯度分別處理48h，利用倒置熒光顯微鏡觀察各培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.3細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力用胰蛋白酶消化C918細(xì)胞，低速常溫離心收集細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基吹打混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，倍比稀釋至1×103/mL，將混勻的細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，加入SAHA 1.25μmol/L處理48h，空白對(duì)照組加入同等量的DMSO。48h后，換用新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞14d。每孔加入4%多聚甲醛1mL，固定細(xì)胞15min，去除固定液，加入適量結(jié)晶紫染液30min，然后用水沖洗，放置常溫干燥。用Image J計(jì)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.2.4EdU染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期的C918細(xì)胞，常規(guī)操作，消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以8×104個(gè)/皿接種于共聚焦皿中。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜或狀態(tài)穩(wěn)定后，加入SAHA 1.25μmol/L處理48h，空白對(duì)照組加入同等量的DMSO。稀釋EdU原液，每孔加100μL 50μmol/L EdU培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育2h，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞3次。加入4%多聚甲醛固定，30min后棄固定液。每孔加入0.3% Triton X-100 100μL，室溫處理15min。配制Click反應(yīng)液，室溫避光孵育35min。棄反應(yīng)液，1mL的PBS洗3次。制備適量1000×Hoechst 33342反應(yīng)液，避光保存。每孔加入100μL 1× Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、孵育35min后，棄結(jié)晶紫染色反應(yīng)液，每孔加入1mL的PBS洗3次。

1.2.5細(xì)胞蛋白質(zhì)提取和定量收集培養(yǎng)48h的各組C918細(xì)胞，冰板上操作，倒干培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗3遍，用負(fù)壓吸引器將PBS吸凈。每皿加入約200μL裂解液，收集細(xì)胞裂解液于1.5mL離心管中，4℃裂解20min，在低溫高速離心機(jī)中4℃ 12 000r/min離心20min，取上清液用BCA法行蛋白定量，加入5×loading buffer煮沸8min。

1.2.6Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)每孔上樣相同蛋白量，置于電泳緩沖液中電泳，電泳結(jié)束后，采用恒壓90V濕轉(zhuǎn)90min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床慢速封閉2h，將目的條帶切下，置于相應(yīng)一抗中并在4℃下孵育過(guò)夜。第2d用TBS緩沖液(TBST)漂洗PVDF膜3次，每次10min。室溫下?lián)u床孵育二抗120min，采用Bio-Rad ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行灰度值檢測(cè)，用Image Lab軟件統(tǒng)計(jì)各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1SAHA呈濃度依賴性降低C918細(xì)胞活力空白對(duì)照組C918細(xì)胞形態(tài)呈梭形，48h后細(xì)胞密度達(dá)到90%(圖1A)。給予不同濃度SAHA藥物處理48h后，C918細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮變形，且細(xì)胞貼壁不良、生長(zhǎng)顯著受到抑制，細(xì)胞密度逐漸減小，該作用隨藥物濃度的升高更為明顯(圖1B～D)。當(dāng)藥物濃度增加到2.5μmol/L時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡(圖1D)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、SAHA 0.625μmol/L組、SAHA 1.25μmol/L組、SAHA 2.5μmol/L組C918細(xì)胞存活率分別為(100±7)%、(77±10)%、(58±12)%、(22±14)%。與空白對(duì)照組相比，SAHA呈濃度依賴性地抑制C918細(xì)胞活力(均P<0.05)，藥物濃度為2.5μmol/L時(shí)抑制率達(dá)80%。

圖1 不同濃度SAHA對(duì)C918細(xì)胞形態(tài)和活力的影響 A：空白對(duì)照組；B：SAHA 0.625μmol/L組；C：SAHA 1.25μmol/L組；D：SAHA 2.5μmol/L組。

2.2SAHA呈濃度依賴性降低C918細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)SAHA可呈濃度依賴性地降低C918細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白c-Myc以及細(xì)胞周期蛋白CyclinA2和CDK2的表達(dá)(圖2)，與空白對(duì)照組(100.00±0.00)%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)SAHA濃度為0.625μmol/L時(shí)，將c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別降低到(67.33±2.08)%、(71.66±1.52)%和(75.00±5.00)%；當(dāng)SAHA濃度為1.25μmol/L時(shí)，c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別降低到(45.67±1.52)%、(42.67±4.04)%和(52.33±2.52)%；而當(dāng)SAHA濃度為2.5μmol/L時(shí)，其抑制作用最明顯，c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別降低到(29.00±2.53)%、(28.00±6.69)%和(35.00±5.00)%。

圖2 SAHA作用下C918中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá) c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白表達(dá)檢測(cè)條帶。

2.3SAHA可降低C918細(xì)胞EdU染色和細(xì)胞集落形成能力SAHA濃度為1.25μmol/L時(shí)，可將EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例降低到(13.80±4.50)%，與空白對(duì)照組的陽(yáng)性比例(34.80±1.64)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3A。同時(shí)，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示，與空白對(duì)照組(142.67±8.74)%相比，1.25μmol/L SAHA組(49.33±14.76)%細(xì)胞克隆數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3B。

圖3 SAHA對(duì)C918細(xì)胞EdU染色和細(xì)胞克隆的影響 A：EdU染色圖；B：細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)圖。

2.4SAHA呈濃度依賴性抑制C918細(xì)胞中HDAC7和FGF18表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，隨著SAHA處理濃度的增加，C918細(xì)胞中HDAC7和FGF18蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，見圖4。當(dāng)SAHA濃度為0.625μmol/L時(shí)，HDAC7和FGF18蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降到(75.67±1.53)%和(75.00±4.36)%，與空白對(duì)照組(100.00±0.00)%比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)SAHA濃度為1.25μmol/L時(shí)，HDAC7和FGF18蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降到(46.67±3.61)%和(55.67±6.44)%，與空白對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；當(dāng)SAHA濃度為2.5μmol/L時(shí)，HDAC7和FGF18蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降到(30.33±5.14)%和(41.67±7.97)%，與空白對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 不同濃度SAHA對(duì)HDAC7和FGF18蛋白表達(dá)量的影響HDAC7和FGF18的蛋白表達(dá)檢測(cè)條帶。

3 討論

作為成人發(fā)病率最高的眼內(nèi)腫瘤，大多數(shù)的CM患者被診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中以肝轉(zhuǎn)移最為常見[17-18]。目前CM治療缺乏特異性強(qiáng)的化療策略[19]，臨床治療采用的腫瘤手術(shù)切除常需聯(lián)合眼球摘除，創(chuàng)傷大，但卻很難有效降低其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，同時(shí)對(duì)患者的心理和遠(yuǎn)期生存質(zhì)量均會(huì)產(chǎn)生極大負(fù)面影響。因此，對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)并對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)行阻斷是降低腫瘤復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，以及提高患者生存率的重要因素。

SAHA作為經(jīng)典的HDACi之一，能夠在對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性作用的濃度下發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)。同時(shí)，研究證明SAHA能抑制耐藥性黑色素瘤生長(zhǎng)[20-21]。另外，已有研究指出HDACi能抑制非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞系的增殖。惡性腫瘤細(xì)胞最主要的危害是具有無(wú)限增殖的潛能。而SAHA在多種惡性腫瘤中都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[22-24]，然而其在CM細(xì)胞中是否具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，SAHA對(duì)C918細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且SAHA濃度介于0.625～2.5μmol/L，該藥物隨著濃度的增加抑制作用也增強(qiáng)，這與其在肺癌腫瘤中的作用相一致。以上結(jié)果表明，SAHA在CM細(xì)胞系C918細(xì)胞中發(fā)揮明顯的抑制細(xì)胞增殖的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，HDAC7在多種腫瘤中均能起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[25-28]，且該作用與上調(diào)FGF18信號(hào)通路相關(guān)。而FGF18在細(xì)胞分化和生長(zhǎng)，炎癥反應(yīng)，組織修復(fù)，血管新生，骨骼生長(zhǎng)以及腫瘤細(xì)胞增殖中扮演了重要角色[29-34]。作為HDAC家族抑制劑，SAHA抑制C918細(xì)胞增殖的作用是否與調(diào)節(jié)HDAC7/FGF18信號(hào)有關(guān)還不清楚。此外，以往研究表明，在肺癌中SAHA能夠通過(guò)抑制HDAC降低c-Myc和CyclinA2的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，SAHA處理的C918細(xì)胞中c-Myc和CyclinA2的表達(dá)顯著降低；同時(shí)，細(xì)胞周期蛋白CDK2的表達(dá)也隨之降低。更為重要的是，SAHA還能夠濃度依賴性抑制HDAC7和FGF18在C918細(xì)胞中的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAHA能夠通過(guò)抑制HDAC7/FGF18信號(hào)，降低增殖相關(guān)蛋白c-Myc、細(xì)胞周期蛋白CyclinA2、CDK2的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探討了SAHA對(duì)C918細(xì)胞增殖影響的相關(guān)機(jī)制，證明SAHA能夠通過(guò)調(diào)控HDAC7/FGF18信號(hào)抑制C918細(xì)胞增殖，這為SAHA應(yīng)用于CM患者臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。需要指出的是本次研究仍有一定的局限性，由于本研究只采用了一種CM細(xì)胞系，故此次研究結(jié)論對(duì)其他CM細(xì)胞系是否可以推廣暫不能確定。因此SAHA對(duì)其他CM細(xì)胞系的增殖、代謝、轉(zhuǎn)移等相關(guān)生物學(xué)功能的影響及機(jī)制研究將是我們要進(jìn)一步探討的問(wèn)題。