劉國平，于晶晶

白細胞介素10（interlekin-10，IL-10）是已知的細胞因子網(wǎng)絡中為數(shù)不多的一種抑制性細胞因子，主要由Ⅱ型輔助T細胞分泌產生，具有重要的免疫調節(jié)功能和抗炎作用，其生物學效應在重癥感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，已有的研究資料顯示IL-10有望成為臨床相關疾病治療的新選擇[1-3]。本文旨在利用RT-PCR技術從人外周血單個核細胞中克隆人IL-10的cDNA并構建其真核表達質粒，為進一步研究IL-10基因在細胞內的表達特征及其影響因素和探討臨床開展IL-10基因治療相關疾病的安全性與可行性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 總RNA分離試劑盒、RT-PCR試劑盒、PCR產物純化試劑盒、質粒DNA提取與純化試劑盒，Qiagen公司產品；大腸桿菌 JM109菌株、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶 XhoⅠ （C↓TCGAG）與BamHⅠ （G↓GATCC）、DNA相對分子量Maker，Promega公司產品；真核表達質粒載體 pcDNA4/HisMax A，Invitrogen公司產品；DMEM培養(yǎng)粉，Gibico公司產品；優(yōu)級胎牛血清，TBD生物技術研究中心產品；淋巴細胞分離液，北京京科生物技術公司產品；引物合成由上海生工生物技術服務公司完成。其他試劑均為市售國產或進口分析純級產品。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞的分離與培養(yǎng) 采用Ficoll密度梯度法分離人外周血單個核細胞，按2×106/L培養(yǎng)于含DMEM液的培養(yǎng)瓶內，其中含105 U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，100 ml/L胎牛血清，20 mg/L ConA，于 50 ml/L CO2、37℃培養(yǎng) 16 h[4]。

1.2.2 總RNA提取 將1.2.1中含單個核細胞的培養(yǎng)液傾入一無RNA酶、無菌的50 ml的離心管中，4℃，1500 r/min離心5 min，收集細胞，按總RNA分離試劑盒說明提取總RNA，取5 μl RNA進行5%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射光下觀察18S、28S rRNA帶，確定RNA提取效果。

1.2.3 IL-10 cDNA的合成及擴增、純化 根據(jù)GeneBank中Human IL-10全長開放讀框基因mRNA序列（NM 000572）設計引物，上游引物：5’-CTCGGATCCAAGGCATG CACAGCTCAGC-3’（包含起始密碼子和5’修飾限制性內切酶BamHⅠ酶切位點），下游引物：5’-CTCCTCGAGCCTGA TGTCTCAGTTTCGTA-3’（包含終止密碼子和5’修飾限制性內切酶XhoⅠ酶切位點）。以提取的總RNA為模板，RT-PCR一步法合成并擴增IL-10 cDNA。逆轉錄條件：50℃，30 min進行反轉錄，隨即95℃滅活反轉錄酶15 min。PCR條件：起動 94℃、5 min，變性 94℃、1 min，退火 52℃、1 min，延伸72℃、1 min，以上共35個循環(huán)，72℃終末延伸10 min。5%瓊脂糖凝膠電泳，分析鑒定RT-PCR產物并純化回收。以上按試劑盒說明書進行操作

1.2.4 重組真核表達質粒的構建與鑒定分析 37℃下，限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ分別消化RT-PCR產物和質粒載體pcDNA4/HisMax A各4 h，消化產物分別進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳并純化回收。16℃，T4DNA連接酶作用下反應16 h，構建真核表達質粒。轉化感受態(tài)細胞JM109菌種，氨芐青霉素（50 μg/ml）LB平板常規(guī)篩選陽性重組體。接種LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)。4℃下，6000 g離心15 min，除凈培養(yǎng)液。按質粒提取試劑盒使用說明純化提取重組質粒載體。以重組質粒為模板進行PCR擴增，引物及反應條件同前，鑒定重組質粒的正確性。重組質粒分別進行BamHⅠ單酶切和 XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切分析。上海生物工程技術服務公司ABI PRISMTM310型測序儀對IL-10 cDNA序列測定分析。

2 結 果

2.1 PBMC中總RNA提取及測定 提取的PBMC總RNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見完整的28S和18S rRNA，條帶清晰，顯示組織中提取的總RNA完整，RNA無明顯降解（圖1）。紫外分光光度計測定，提取的總RNA OD260光密度值為0.0892，RNA 含 量 0.18 μg/μl，OD260/OD28=0.0892/0.0487 ≈1.83，以上結果表明RNA樣品純度滿意。

2.2 RT-PCR結果 以PBMC總RNA為模板合成的cDNA第一鏈，進行PCR擴增，產物經瓊脂糖電泳分析，與DNA Marker比較，擴增產物的大小約為0.54 kb，與hIL-10基因大小相符合（圖2）。

2.3 重組真核質粒限制性酶切分析結果 重組真核表達質粒經BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切，電泳可見大小約為5.3 kb和0.54 kb的2條帶，分別與質粒載體pcDNA4/HisMax A和RT-PCR產物大小一致。BamHⅠ單酶切后，電泳可見一條帶大小約為5.8 kb。同時以重組真核表達質粒為模板進行PCR擴增，其產物與從PBMC總RNA經RT-PCR克隆獲得的hIL-10片段大小相符。以上均表明重組克隆成功，hIL-10基因完整插入質粒載體pcDNA4/HisMax A中（圖3）。

2.4 DNA序列測定結果 PCR產物經純化回收，限制性內切酶消化產生粘性末端后，定向克隆入質粒載體pcDNA 4HisMax A，重組質粒進行DNA測序，結果證實克隆的hIL-10基因與GeneBank中所報道的hIL-10基因序列一致，表明重組質粒載體克隆成功。

圖1 PBMC中提取總RNA瓊脂糖電泳結果

圖2 RT-PCR產物瓊脂糖電泳結果

圖3 重組真核表達質粒酶切電泳分析

3 討 論

白細胞介素-10是1989年Fiorentino等首先發(fā)現(xiàn)的，因其有抑制多種細胞因子合成的功能曾被稱之為細胞因子合成抑制因子，主要由Th2細胞產生[5]。人IL-10基因定位于第1號染色體的1q31～1q32區(qū)域，為單拷貝基因，整個基因含有3.5 kb，其轉錄生成的mRNA為含1.8 kb的核苷酸序列，其互補脫氧核糖核酸（cDNA）序列中含有一個編碼178個氨基酸的開放讀碼框架，但在一般的情況下表達水平低下，只有在某些特殊情況下或細胞受刺激后才出現(xiàn)高水平的表達。已有的研究表明，IL-10的生物學功能主要是[6-10]：①抑制單核細胞依賴性Th細胞的增生，同時抑制Th1細胞類細胞因子如 IL-1、IL-2、INF-γ、TNF-α 等的合成及活性； ②抑制單核細胞表面MHCⅡ抗原分子HLA-DR/DP及DQ的表達，降低抗原提呈細胞的抗原提呈能力，阻斷抗原特異性的單核、巨噬細胞因子；③通過抑抑制INF-γ的產生抑NK細胞的活性。這些生物學作用符合了臨床部分疾病如重癥感染、自身免疫性疾病和器官移植等疾病的治療需要。

基因治療是指將外源基因（目的基因），通過一定載體導入靶細胞（受體細胞），以補償靶細胞的基因缺陷或蛋白分泌水平，或轉基因的蛋白產物封閉靶細胞某種受體，使靶細胞獲得新的生物學行為或功能，從而達到治療疾病的目的。獲得目的基因，是實施基因治療從而達到治療疾病目的的一項重要步驟。目前，獲得目的基因的主要方法有：①真接從生物體基因組中機械剪切（超聲）或內切酶酶解后分離出目的基因；②提取組織中的mRNA，以其為模板，通過反轉錄酶合成與mRNA互補的cDNA；③人工體外合成；④利用PCR技術擴增特定的基因片段。通過mRNA逆轉錄合成cDNA的方法，不但可以獲得較為完整的連續(xù)編碼順序，且容易在宿主中實現(xiàn)目的基因的表達[11]。

根據(jù)質粒載體pcDNA4/HisMaxA和目的片段cRNA序列酶切位點特征，分別在上游引物5，端加入BamHⅠ酶切位點，下游引物5，端加入XhoⅠ酶切位點。當目的基因與載體分別經上述二種酶雙酶切后，便產生兩個不同的粘性末端，使目的基因IL-10 cDNA片段與質粒載體在適當位點發(fā)生定向重組。此方法具有連接效率高、連接點保留原來酶切位點的特點，插入片段的方向唯一，從而保證了目的基因與表達載體連接的準確性。

本文實驗中通過對人外周血單個核細胞的體外分離和培養(yǎng)，提取總RNA，采用RT-PCR方法進行基因擴增，獲得目的片段后將其與質粒載體進行連接，經酶切鑒定和測序分析，所獲得的片段基因序列與IL-10的序列一致，實現(xiàn)了IL-10基因克隆及重組真核表達質粒構建，為今后臨床進一步研究IL-10基因治療以及相關蛋白提純、抗體制備奠定了基礎。

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