廖永洪，張許科，孫進忠，胡東波，谷世江，劉 栓，白朝勇

(1．國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心生物制品研究所，河南洛陽 471003;2．普萊柯生物工程股份有限公司，河南洛陽 471003)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)可引起豬支原體肺炎，又稱地方流行性肺炎，是豬的一種慢性消耗性呼吸道病，臨床感染率極高。其主要癥狀為咳嗽和氣喘，以高發(fā)病率和低死亡率為特點。豬群一旦感染Mhp，便難以清除，不僅嚴重影響豬群的生長發(fā)育，用藥量增加，而且容易繼發(fā)感染PRRSV、PCV等，從而導致多種疫苗接種失?。?－2］。豬肺炎支原體作為豬呼吸道病綜合征的重要病原之一，直接或間接對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬肺炎支原體體外培養(yǎng)對生長條件要求苛刻，營養(yǎng)要求高且生長速度緩慢，分離過程中受豬的其他支原體(如豬鼻支原體)的影響，導致豬肺炎支原體分離鑒定難度較大。本研究通過采集河南各地豬場疑似豬肺炎支原體感染豬病變肺臟，進行了豬肺炎支原體的分離、培養(yǎng)，得到一分離株，命名為HN0613株，并對其進行了生物學特性研究，包括PCR、測序分析、生化鑒定、生長抑制和致病性試驗。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料來源 2006年從河南省各地采集疑似豬支原體肺炎病變肺臟，共16份。

1．1．2 培養(yǎng)基 豬肺炎支原體Friis培養(yǎng)基，BD公司;豬血清，GIBCO公司;酚紅指示劑，美國AMRESCO公司。

1．1．3 生化試劑 化學試劑，國藥集團化學試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒，TIANGEN公司;狄氏染色試劑盒，重慶龐通醫(yī)療器械有限公司;生化鑒定試劑，杭州天和微生物試劑有限公司。

1．1．4 陰性、陽性血清 兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，由普萊柯生物工程股份有限公司制備。未免兔血清作為陰性血清。

1．1．5 實驗動物 1～2周齡健康仔豬(經(jīng)IDEXX試劑盒檢測其血清中Mhp及PRRSV抗體，均為陰性)，由河南省伊川縣某豬場提供。

1．1．6 儀器與設(shè)備 生物安全柜(蘇州安泰，BHC－1300ⅡA2)、CO2培養(yǎng)箱(德國 Thermo，Heracell 240Ⅰ)、顯微鏡(Leica，DM750)、PCR 儀(墨西哥BIORAD，PTC0200)。

1．2 方法

1．2．1 病料處理 取疑似支原體肺炎病變肺臟，在超凈臺內(nèi)用無菌手術(shù)剪刀剪取發(fā)病部位邊緣組織，放入無菌平皿，將病肺組織剪成1～2 mm3碎塊，接種Friis肉湯，37℃培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)液的pH值變化。培養(yǎng)液變色時，取第一代經(jīng)0．45μm過濾器過濾的培養(yǎng)物0．5 mL接種到1．5 mL含青霉素2000 U/mL的Friis肉湯培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基變黃后直接取培養(yǎng)物進行移植傳代。

1．2．2 形態(tài)學觀察

1．2．2．1 純化 取0．2 mL培養(yǎng)物涂布于 Friis平板固體培養(yǎng)基表面，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個菌落接種于 Friis肉湯，培養(yǎng)基顏色變黃后取0．2 mL培養(yǎng)物涂布于Friis平板固體培養(yǎng)基表面置37℃，5%CO2條件下進行純化培養(yǎng)，如此進行純化培養(yǎng)2次。將最后一次純化培養(yǎng)生長的支原體樣菌落接種Friis液體培養(yǎng)基所得的顏色變黃培養(yǎng)物保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2．2 鏡檢 取培養(yǎng)基變黃的培養(yǎng)物和單個菌落進行涂片，分別做革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。

1．2．2．3 菌落形態(tài)觀察 按參考文獻［3］進行，采用無菌方法從固體培養(yǎng)基上切下菌落，放到載玻片上，在兩邊墊上竹簽，滴上狄氏染色液后再蓋上一塊玻片，置于4℃染色30 min后，低倍鏡下觀察結(jié)果。

1．2．3 PCR鑒定及測序分析 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。PCR引物參考文獻進行合成［4］。FSp36，5’－ GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT－3’Rsp36，5’－GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG－3’，上海生工合成。PCR 反應(yīng)體系:超純水 34．5μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物各2 μL、模板2 μL、TaqDNA聚合酶0．5μL。按下列參數(shù)進行PCR反應(yīng):預(yù)變性94℃ 3 min;94℃ 30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)后;72℃終延伸10 min。擴增結(jié)束后取上述產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。直接將有特異性條帶的PCR產(chǎn)物及引物提交至上海生工進行測序分析。

1．2．4 生化試驗 生化試驗參考文獻［3］進行。主要進行洋地黃皂甙敏感性試驗、尿素酶試驗、葡萄糖分解試驗、精氨酸水解試驗、三苯基氯化四氮唑(TTC)還原試驗、七葉甙水解試驗、甘露醇分解試驗、薄膜和斑點形成試驗。

1．2．5 生長抑制試驗(GIT)Friis平板接種0．1 mL對數(shù)生長期的分離株培養(yǎng)物，將未稀釋的抗血清25μL吸附于滅菌的6 mm濾紙片，將吸有血清的濾紙片貼附于平板表面，培養(yǎng)至菌落可見。正常兔血清處理的紙片作為陰性對照。培養(yǎng)觀察圓紙片周圍有無菌落抑制環(huán)的產(chǎn)生。抑制寬度達1 mm以上時，判為豬肺炎支原體陽性［3］。

1．2．6 代謝抑制試驗(MIT) 在10支小管中分別加入1 mL Friis肉湯，于第1支小管內(nèi)加入1 mL兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，混勻后取1 mL于第2支小管，如此進行2倍梯度稀釋至第8支小管，混勻后棄去1 mL。取對數(shù)生長期分離株培養(yǎng)物，用Friis肉湯10000倍稀釋，在第1～9支小管內(nèi)分別加入1mL稀釋培養(yǎng)物，第10支管內(nèi)加入1 mL陽性血清，置37℃培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)液的顏色變化，當菌液對照管顏色變黃時，小管中培養(yǎng)液顏色未變黃的血清最高稀釋度的倒數(shù)即為抑制價。取正常兔血清，按以上程序進行操作，作為代謝抑制試驗的對照。

1．2．7 分離菌株的致病性 將分離菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管注射1～2周齡健康易感豬3頭，每頭5mL(108CCU)。另設(shè)3頭條件相同的對照豬，各氣管注射培養(yǎng)基5 mL，作為對照。試驗豬、對照豬隔離飼養(yǎng)。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無抗生素。觀察28 d，每日測體溫。注射28 d后剖檢，根據(jù)豬支原體肺炎肺病變指數(shù)記分標準對試驗豬的肺病變進行記分。試驗組與對照組進行肺病變指數(shù)差異分析。對試驗豬及對照豬按1．2．1項進行豬肺炎支原體的分離，對分離株按1．2．3項方法進行PCR鑒定。

2 結(jié)果

2．1 培養(yǎng)結(jié)果 16份病料中僅有1份病料接種的培養(yǎng)基7 d后變黃色，過濾接種后5 d培養(yǎng)液變黃，培養(yǎng)液均勻混濁，轉(zhuǎn)接于含青霉素的Friis培養(yǎng)基，6 d后培養(yǎng)液變色，取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基后，菌落生長入培養(yǎng)基內(nèi)部。菌落呈典型煎荷包蛋狀，與支原體菌落形態(tài)相符，命名為HN0613株豬肺炎支原體。

2．2 形態(tài)學觀察 革蘭氏染色未發(fā)現(xiàn)細菌，瑞氏染色發(fā)現(xiàn)有支原體樣菌體。將固體培養(yǎng)基上菌落經(jīng)狄氏染色后在低倍鏡下觀察，菌落被染成不褪色的中心深藍色菌落(圖1)，與支原體菌落染色特性相符。

圖1 Friis固體培養(yǎng)基豬肺炎支原體菌落狄氏染色后形態(tài)圖

2．3 PCR鑒定及測序分析 所提取的分離培養(yǎng)物模板經(jīng)PCR擴增后，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，待檢病料或培養(yǎng)物均在750～1000 bp之間接近1000 bp的位置有一條帶，與預(yù)期948 bp相符(圖2)。將PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中Mhp部分序列進行同源性比較，結(jié)果顯示，HN0613分離菌株P(guān)36基因序列與NCBI中公布的Mhp P36基因序列相應(yīng)序列同源性為98%以上。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2．4 生化試驗 分離菌株生化反應(yīng)與豬肺炎支原體生化特性相符(表1)。

表1 HN0613分離株生化試驗結(jié)果表

2．5 生長抑制試驗 分離株HN0613在吸有抗血清的濾紙片周圍出現(xiàn)了直徑為2．38 mm的抑菌環(huán)，而正常兔血清處理的濾紙片周圍無抑菌環(huán)。

2．6 代謝抑制試驗 培養(yǎng)至第5天時，菌液對照管及代謝抑制試驗對照管的培養(yǎng)液均變?yōu)辄S色，血清對照管培養(yǎng)液顏色無變化，加有抗血清的第6～8支小管內(nèi)的培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，即其代謝抑制價為64。2．7 分離菌株的致病性試驗 將菌株培養(yǎng)物經(jīng)氣管內(nèi)注射10日齡健康易感豬(IHA抗體＜1∶5)，10 d后均相繼出現(xiàn)咳嗽和氣喘等豬支原體肺炎癥狀。28 d后剖檢可見輕度肺病變，病變指數(shù)在9～15之間。而對照組均未出現(xiàn)上述癥狀及病變，剖檢豬肺部未見異常。臨床觀察和肺部病變結(jié)果見表2。

表2 HN0613分離株對仔豬感染情況

對試驗組3頭豬進行豬肺炎支原體分離，對其變色液體培養(yǎng)物按1．2．3項步驟進行PCR檢測，結(jié)果在略小于1000bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖2泳道3)，目的條帶大小為948bp，證明分離病原為豬肺炎支原體。

3 結(jié)論

從豬支原體肺炎典型病例的病肺中分離到了疑似豬肺炎支原體的微生物，經(jīng)各項鑒定具有豬肺炎支原體的特性，生長抑制試驗、代謝抑制試驗、PCR及測序鑒定結(jié)果表明該微生物屬于豬肺炎支原體，命名為豬肺炎支原體HN0613株。豬肺炎支原體HN0613在Friis培養(yǎng)基中培養(yǎng)含量可達108CCU/mL，對健康易感豬具有一定的毒力，可致其產(chǎn)生運動后咳嗽、氣喘、呼吸困難等支原體肺炎典型的臨床癥狀及肺部肉變。因此該菌株可作為疫苗候選株進一步研究。

［1］ 金升藻．豬支原體肺炎的診斷與綜合防治［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，(3):52 －53．

［2］ 沈青春，寧宜寶，覃青松．豬肺炎支原體的研究進展［J］．中國獸藥雜志，2003，37(6):26 －30．

［3］ 曹澍澤．獸醫(yī)微生物學及免疫學技術(shù)［M］．北京:北京農(nóng)業(yè)大學出版社，1992:49－50．

［4］ JCaron，MOuardani，SDea．DiagnosisandDifferentiationof MycoplasmahyopneumoniaeandMycoplasmahyorhinisInfections inPigsbyPCRAmplificationofthep36andp46Genes［J］．JournalofClinicalMicrobiology，2000，38(4):1390 －1396．