吳 悅，陳儉清，趙玉蓮，李賢賢，李 鶴，李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150030)

連翹顆粒劑是針對現(xiàn)階段細(xì)菌的廣泛耐藥性［1，2］，而研制出的能減少耐藥性的中成藥制劑，具有清熱解毒之功效，主要用于預(yù)防和治療豬鏈球菌引起的疾病，有效的解決了豬鏈球菌耐藥性的問題［3－6］。其主要成分連翹是木犀科連翹屬［7］，具有抗菌、強(qiáng)心、利水、清熱解毒等功效。為了對連翹顆粒劑的安全性進(jìn)行客觀評價，根據(jù)農(nóng)業(yè)部新獸藥一般毒性試驗技術(shù)要求［8］，對其進(jìn)行了急性毒性試驗和亞急性毒性試驗研究，為新藥的臨床階段提供理論依據(jù)。

1 材料

1．1 試驗動物 清潔級昆明系小鼠，體重在17～20 g之間，雌雄各半，雌性未產(chǎn)無孕，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1．2 試驗藥物及化學(xué)試劑 連翹顆粒劑，自行研制的耐藥抑制劑其主要成分是連翹酯苷。具有清熱解毒，散結(jié)消腫之功效，臨用前用蒸餾水配成相應(yīng)的濃度;測定生化指標(biāo)(GPT、GOT、AKP、肌酐和尿素氮)的試劑盒(批號:20111010)，南京建成生物工程研究所。

1．3 試驗儀器 BT224S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;7504型紫外分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司;DK－8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;TGL－16G離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司;DH6000A型恒溫箱，天津市泰斯特儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡等。

2 方法

2．1 急性毒性試驗 取20只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組雌雄各半。試驗組一次性灌胃給藥100 g/kg(最大給藥劑量)，對照組灌以等容積的生理鹽水。連續(xù)觀察7 d。根據(jù)上下法［9］，找出0%和100%的死亡率的藥物濃度。

2．2 亞急性毒性試驗

2．2．1 動物分組及給藥劑量 將80只小鼠隨機(jī)分成四組，每組20只，雌雄各半。分別為連翹顆粒劑高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組，給藥劑量根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按最大給藥量從高到低分別給藥為100 g/kg、33．3 g/kg、10 g/kg，對照組灌于等量的生理鹽水。用金屬灌胃器經(jīng)口給藥，每天2次。試驗期間所有小鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。

2．2．2 檢測指標(biāo) 分別在給藥的第7日和第14日時，對各組小鼠進(jìn)行一般癥狀檢查。將小鼠斷尾采血，然后對其血液生理指標(biāo) (血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、白細(xì)胞分類計數(shù))進(jìn)行測定。將小鼠進(jìn)行眼球采血后，分離血清，進(jìn)行血液生化指標(biāo)(GPT、GOT、AKP、肌酐和尿素氮)的檢測。

2．3 統(tǒng)計學(xué)處理 對一般癥狀檢查采用 t檢驗［10］方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。血液生理生化試驗結(jié)果數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)的形式表示。用Spss17．0中One－way AVONA的LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。

3 結(jié)果

3．1 急性毒性試驗最大耐受量測定結(jié)果 當(dāng)給藥量5000 mg/kg時，致死量仍然為0%，無法測出半數(shù)致死量(LD50)，因受試藥物的濃度或體積限制，只能測出最大耐受量。

以100 g/kg的藥物濃度給小鼠灌胃，給藥當(dāng)天小鼠被毛光滑，有腹瀉癥狀，糞便呈黃褐色，采食、活動減少;第2日后小鼠采食量、活動量及糞便情況都恢復(fù)正常，與空白組無明顯差異。到第7日時，小鼠未出現(xiàn)死亡狀況。

3．2 亞急性毒性試驗結(jié)果

3．2．1 連翹顆粒劑對昆明系小鼠一般癥狀的影響

在試驗期間，均未發(fā)現(xiàn)有小鼠因藥物原因而出現(xiàn)的死亡狀況。試驗中各組小鼠的進(jìn)食量、飲水量、精神狀況、被毛光澤度無異常變化。各組小鼠的體重均在正常范圍內(nèi)變化。結(jié)果表明各組差異不顯著，見表1。

3．2．2 連翹顆粒劑對昆明系小鼠血液生理指標(biāo)的影響

連翹顆粒劑對昆明系小鼠生理指標(biāo)的影響結(jié)果見表2。3個劑量組的血紅蛋白、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比與對照組間差異均不顯著(P＞0．05)。紅細(xì)胞計數(shù)各組14 d比7 d相比較，除高劑量組外其他三組的值略有升高，其中中低劑量組增加幅度較大。白細(xì)胞計數(shù)7 d和14 d各組比較變化均不明顯，14 d與7 d各劑量組相比較均有不同程度的降低。淋巴細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比在第14日時都比第7日時有較大幅度的增加。血紅蛋白在第14 d時除高劑量組降低外，其他三組均有不同程度的增加。

表1 連翹顆粒劑對昆明系小鼠體重的影響(n=20)

表2 連翹顆粒劑對昆明系小鼠血液部分生理指標(biāo)的影響(X ±s，n=20)

3．2．3 連翹顆粒劑對昆明系小鼠生化指標(biāo)的影響連翹顆粒劑對昆明系小鼠生化指標(biāo)的影響結(jié)果見表3。第7日高劑量組的GOT值高于其他三組，在第14日時高劑量組的GOT與對照組差異顯著(P＜0．05);在第14日，各組的GPT均有不同程度的增加;除中劑量組的CR值減少，其他三組的CR值有增加;BUN的值均有不同程度的增加，其中對照組和中劑量組的增加幅度較大;空白組和高劑量組的AKP增加，而中低劑量組的AKP減少。除第14日的GOT高劑量組與對照組差異顯著(P＜0．05)外，其他各組的各項指標(biāo)均差異不顯著(P＞0．05)。

表3 連翹顆粒劑對昆明鼠部分生化指標(biāo)的影響(X ±s，n=20)

4 討論

連翹顆粒劑為自主研發(fā)的耐藥抑制劑，主治豬鏈球菌引起的相關(guān)疾病。連翹顆粒劑是向連翹提取物中加入乙醇，經(jīng)濾過、回收、濃縮等步驟后，加入糊精和糖粉所得到的混合物制備成顆粒狀所制成的［11－12］。連翹是我國傳統(tǒng)中藥，已被載入藥典，用于治療風(fēng)熱感冒、高熱煩渴等癥狀，但目前，連翹在用于動物疾病的防治方面的研究較少［13］。所以連翹顆粒劑的研發(fā)，目的是要解決由豬鏈球菌所引起的相關(guān)疾病的耐藥性問題。

從連翹顆粒劑的急性、亞急性毒性試驗結(jié)果分析，在用藥期間各劑量組的昆明系小鼠均未出現(xiàn)因藥物原因而死亡的情況。根據(jù)新獸藥一般毒性試驗技術(shù)要求，短期給予藥物毒性較低，比較安全。在試驗期間，小鼠的體重均有不同程度的增加。各劑量組之間差異不顯著，表明藥物對小鼠的食欲及健康狀況沒有影響。

血液生理指標(biāo)是檢驗藥物毒性的很重要的指標(biāo)，試驗結(jié)果表明，紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白的含量與對照組比較差異均不顯著，故判斷藥物的毒性低。已有研究表明，根據(jù)化學(xué)物急性毒性(LD50)劑量分級表，連翹酯苷分級為低毒［14］。而連翹酯苷不止對實驗動物本身，對胚胎、胎兒和致畸性也均無明顯毒性［15］。由此可見，連翹酯苷作為連翹顆粒劑的主要成分，在以往的實驗中證實了其低毒安全的特性。

血液生化指標(biāo)是測定藥物對肝腎的毒性作用，本試驗結(jié)果表明，除第14日的谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測定項的高劑量組出現(xiàn)了差異顯著(P＜0．05)外，其他各劑量組的血液生化指標(biāo)均無明顯差異。因轉(zhuǎn)氨酶是反映肝臟功能的重要指標(biāo)，且只有肝臟受到嚴(yán)重傷害時谷草轉(zhuǎn)氨酶才會出現(xiàn)偏高，可以看出，長期服用高濃度的該藥物對肝臟有一定的損害，但中、低劑量組與對照組相比差異不顯著，說明中、低劑量比較安全。

研究發(fā)現(xiàn)連翹酯苷在體內(nèi)外實驗中對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌均有較好的抑制作用［16－17］，應(yīng)用前景廣泛。近期研究表明，連翹中苯乙醇苷類成分具有較強(qiáng)抗菌活性，在評價連翹及其以抗菌為主要功效的制劑質(zhì)量時，以連翹酯苷作為主要特征成分比連翹苷更合適［18］，但其抗菌作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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［8］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．新獸藥一般毒性試驗技術(shù)要求［S］．

［9］ 國家食品藥品監(jiān)督管理局·化學(xué)藥物指導(dǎo)原則(藥理毒理部分各論)GPT1－1，化學(xué)藥物急性毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則［S］．

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