張婉華，鄒 勇，朱永軍，彭麗英，張春玲，蔣鳳英，何錫忠，倪建平

(上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病因之一，可引起母豬尤其是初產(chǎn)母豬的繁殖障礙，表現(xiàn)為母豬受胎率降低，產(chǎn)活仔數(shù)減少和(或)出現(xiàn)死胎、木乃伊胎等［1］。PPV具有凝集紅細(xì)胞的特性，尤其是對豚鼠和人O型紅細(xì)胞。由于人的O型紅細(xì)胞來源受限，因此豚鼠紅細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室診斷中應(yīng)用較多。血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)是PPV抗原、抗體檢測的常用方法之一，也是PPV抗原、抗體檢測最為經(jīng)典的方法［2－5］。1986年潘雪珠等建立了試管法，獲得了較為滿意的結(jié)果［6］，但試驗(yàn)操作及洗滌較為麻煩，且試劑及檢測樣品用量大。本實(shí)驗(yàn)室建立了“U”型微量板HA、HI試驗(yàn)，但由于紅細(xì)胞懸液濃度偏低，判斷結(jié)果往往要等很長時(shí)間。本試驗(yàn)研究了不同紅細(xì)胞懸液濃度、不同液體體積、不同形狀微量板對豬細(xì)小病毒HA、HI試驗(yàn)的影響。

1 材料與方法

1．1 微量板 96孔“U”型微量板和96孔“V”型微量板(底角為90°)。

1．2 抗原及抗體 PPV陰性血清、陽性血清、抗原、67份HA檢測樣品，29份HI檢測樣品，本公司研發(fā)中心提供。

1．3 試劑 Alsever液、pH7．4磷酸緩沖液(PBS)、pH7．2磷酸緩沖液(含Ca2+、Mg2+)、25%白陶土懸液，均按常規(guī)方法配制，116℃15min滅菌，4℃保存。

1．4 豚鼠紅血球的配制 采集健康豚鼠血液，按常規(guī)方法配制成不同濃度的紅細(xì)胞懸液。

1．5 HA試驗(yàn) 96孔“U”微量板和“V”微量板，分別采用100μL和50μL液體體積。試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［5］，略作改進(jìn)。豚鼠紅細(xì)胞懸液分別采用0．25%、0．5%和 1%的濃度。

67份樣品，通過不同濃度的豚鼠紅細(xì)胞懸液，在“U”型和“V”型微量板上進(jìn)行平行試驗(yàn)，比較二者差異。以“U”型微量板、0．25%豚鼠紅細(xì)胞懸液濃度獲得的結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。

1．6 HI試驗(yàn)

1．6．1 血清的處理 29份血清56℃水浴滅活30 min。經(jīng)25%白陶土液和25%豚鼠紅血球懸液處理，收集上清液作為原始血清的1∶8稀釋液。

1．6．2 HI試驗(yàn) 96孔“V”型微量板和“U”型微量板，分別采用25μL和50μL液體體積。試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［5］略作改進(jìn)。豚鼠紅細(xì)胞懸液濃度為0．5%。每次測定時(shí)設(shè)立陽性血清對照、陰性血清對照、抗原對照和紅細(xì)胞對照。

29份血清樣品，在“U”型和“V”型微量板上進(jìn)行平行試驗(yàn)，比較二者差異。以“U”型微量板、0．25%濃度的豚鼠紅細(xì)胞懸液獲得的結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 HA試驗(yàn) 67份樣品在“V”型微量板和“U”型微量板上同時(shí)測定HA抗原效價(jià)。結(jié)果在“U”型和“V”型微量板上用濃度0．25%和0．5%的豚鼠紅細(xì)胞懸液，所獲得的結(jié)果差異不明顯，但在“V”型微量板獲得的結(jié)果更清晰;用1%濃度的紅細(xì)胞懸液，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果差異很大(表1)。

表1 “U”型和“V”型微量板上不同濃度紅細(xì)胞懸液不同液體體積的HA試驗(yàn)結(jié)果

2．2 HI試驗(yàn) 結(jié)果見表2。29份血清在“V”微量板和“U”微量板上同時(shí)測定HI抗體效價(jià)，結(jié)果用0．5%濃度的紅細(xì)胞懸液與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果差異不明顯，但作用時(shí)間明顯縮短，且“V”微量板上獲得的結(jié)果更清晰、更易判斷。

3 結(jié)論

PPV感染診斷方法有多種，但最常規(guī)、最經(jīng)典的HA、HI檢測方法基本可滿足常規(guī)的病原檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查的需要。本研究通過對不同濃度的豚鼠紅細(xì)胞懸液進(jìn)行比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)提高豚鼠紅細(xì)胞懸液的濃度，由原來的0．25%提高到0．5%，用50μL體積進(jìn)行HA試驗(yàn)，用25μL體積進(jìn)行HI試驗(yàn)，在“V”型微量板上的試驗(yàn)結(jié)果更清晰、更易判斷。

［1］ 殷 震，劉景華．動物病毒學(xué)［M］．第二版．北京:科學(xué)出版社，1997．

［2］ 朱潤芝，陳溥言，蘆銀華，等．豬細(xì)小病毒病診斷研究進(jìn)展［J］．中國動物檢疫，2005，22(4):44 －46．

［3］ 蔣玉雯，馮 軍，黃安國，等．豬細(xì)小病毒的流行病學(xué)調(diào)查［J］．中國獸醫(yī)雜志，1990，(3):7 －9．

［4］ 劉艷華，范偉興，王錫樂．豬細(xì)小病毒的研究概況［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2004，31(12):45 －48．

［5］ 中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1919－2007．豬細(xì)小病毒病紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)操作規(guī)程［S］．

［6］ 潘雪珠，唐騏駿，葉向陽，等．用血凝抑制試驗(yàn)檢測豬細(xì)小病毒抗體［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，1985，(4):13 －15．

表2 “U”型和“V”型微量板上0．5%紅細(xì)胞懸液不同液體體積的HI試驗(yàn)結(jié)果