周桂蘭，李旭妮，吳 啟，程君生，王 楠，丁家波，毛開榮，韋海濤，薛水玲，?？〗?/p>

(1．北京市畜牧獸醫(yī)總站，北京 100107;2．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

犬種布魯氏菌是布魯氏菌屬的一個種，主要引發(fā)犬類動物發(fā)生布魯氏菌?。?］，也可以與牛種、羊種、豬種布魯氏菌合并引發(fā)犬的布魯氏菌病(布病)［2］。患病母犬的主要臨床癥狀是流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔，產(chǎn)道炎;患病公犬精液中可攜帶布魯氏菌和大量炎癥細胞及病變精子，部分病犬出現(xiàn)附睪炎和睪丸萎縮等炎癥病變［3］。2012年2月，從貴賓犬的前肢靜脈血中培養(yǎng)分離到疑似布魯氏菌，經(jīng)過血清學試驗、生化試驗、PCR試驗鑒定確定該菌種是犬種布魯氏菌，將該菌株命名為Brucella canis GB1。

1 材料

1．1 血樣來源 無菌采血樣品來自北京一居民家養(yǎng)流產(chǎn)貴賓犬，該犬第一次發(fā)情與自家公狗交配，順利產(chǎn)下4只健康幼犬。第二次發(fā)情與他人養(yǎng)的一只貴賓犬交配，懷孕51 d后發(fā)生流產(chǎn)。該病犬流產(chǎn)后的第115天體表溫度達38．9℃，眼睛有大量膿性分泌物，對其前肢靜脈采血，從全血中分離得到該菌。分離血清保存于－20℃。

1．2 菌株 對照用菌株牛種布魯氏菌A19(CVCC 70202)、羊種布魯氏菌 M28(CVCC 70003)、犬種布魯氏菌RM6/66(CVCC 70701)、豬種布魯氏菌S2(CVCC 70502)均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．3 血清及抗原 犬種布魯氏菌陽性血清(對RM6/66抗原凝集效價為1∶4096)由課題組研制;布魯氏菌陽性血清(批號:201001)與陰性血清(批號:2001－1)、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原(批號:201201)、布魯氏菌病試管凝集試驗抗原(批號:201201)，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．4 培養(yǎng)基 胰眎瓊脂培養(yǎng)基由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。胰酶大豆培養(yǎng)基(TSB)為BD/Difco產(chǎn)品(批號:0144388)。

1．5 試劑 PH8．9 Menzel’s緩沖液(蒸餾水1000 mL、Na2CO30．795 g、NaHCO37．14 g、NaCl5 g、苯酚5 g)、石炭酸生理鹽水。

1．6 試劑盒 細菌基因組DNA提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司(Lot:CA1301);PCR反應試劑盒(Lot:DR001B)、DNA Marker DL2000(Lot:D501A)，TAKARA 公司。

2 方法

參照世界衛(wèi)生組織的文獻［4］，對該菌進行分離培養(yǎng)及鑒定。

2．1 細菌的分離、培養(yǎng)特性和生化試驗

2．1．1 細菌培養(yǎng) 試驗犬采血后立即全血接種胰眎瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h。

2．1．2 菌體、菌落染色 將培養(yǎng)后的菌體涂抹于玻璃片上，火焰固定后革蘭氏染色，油鏡觀察。用布魯氏菌菌落結晶紫染色液對菌落染色15 s后觀察。

2．1．3 生化試驗 將醋酸鉛濾紙條放入增殖的待

檢菌樣品中，37℃培養(yǎng)72 h，觀察結果。

2．2 凝集試驗

2．2．1 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗 試驗血清作1∶1、1∶2、1∶6 倍稀釋，分別取 30 μL 與布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原30μL混合反應，4 min后觀察結果，出現(xiàn)凝集顆粒，液體完全透明記為++++;有明顯的凝集顆粒，液體幾乎完全透明記為+++;有較明顯的凝集顆粒，液體稍透明記為++;稍能見到凝集，液體混濁記為+;無凝集，液體均勻混濁記為－。

2．2．2 試管凝集試驗

2．2．2．1 比濁對照管配制 1∶20稀釋抗原等量稀釋液稀釋(1∶40稀釋)后，再用稀釋液配制成含1∶40抗原0%、25%、50%、75%、100%的懸液。分別代表:菌體完全凝集和沉淀，液體100%清亮記為++++;菌體幾乎完全凝集和沉淀，液體75%清亮記為+++;有顯著的凝集和沉淀，液體50%清亮記為++;有清楚的凝集和沉淀，液體25%清亮記為+;無凝集和沉淀，液體均勻混濁記為－。

2．2．2．2 犬種布魯氏菌病試管凝集試驗抗原用pH8．9 Menzel’s緩沖液作 1 ∶20 稀釋;被檢血清及陰、陽性對照血清用 pH8．9 Menzel’s緩沖液作1 ∶12．5 、1 ∶25、1 ∶50、1 ∶100 倍稀釋。

2．2．2．3 稀釋好的抗原和各稀釋度被檢血清(第1管加入0．1 mL混合后棄0．25 mL，第2管從第1管取0．5 mL加入混合后棄0．5 mL，第3管從第2管取0．5 mL混合后棄0．5 mL，第4管從第3管取0．5 mL混合后棄0．5 mL)及陰、陽性對照血清各加0．5mL混合，置37℃溫箱中作用24 h，取出與比濁對照管比較讀取結果。

2．3 細菌的AMOS－PCR鑒定

2．3．1 菌株復蘇和細菌基因組的提取 牛種、羊種、犬種和豬種布魯氏菌菌種復蘇時，用胰眎瓊脂劃線，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。各挑取單個菌落到1．5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，按照Qiagen細菌基因組抽提試劑盒說明書，提取各細菌基因組DNA，經(jīng)初步定量的核酸置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3．2 引物設計 參照已發(fā)表的文獻［5－6］，設計表1所示的各引物。其中RIS711存在于IS711基因內(nèi)，不同的F引物則對應于IS711基因外側。將Fabortus、Fmelitensis、Fsuis配成引物混合儲存液(簡稱AMS引物)，每種引物濃度為25μmol/L，其他各引物的儲存濃度均配制成25μmol/L。

表1 用于鑒定布魯氏菌種屬的PCR引物序列

2．3．3 PCR反應體系 50μL的反應體系中，含5μL 10× Buffer;8μL 2．5mmol/L dNTPs;AMS引物混合物2 μL，RIS711、Feri、Reri儲存液各2 μL;Taq 酶2U，模板DNA 1μL(或用接種環(huán)蘸取少量菌體)。

2．3．4 PCR反應程序 經(jīng)過優(yōu)化的PCR反應程序為:95℃ 5min后，按94℃ 1min，60℃ 1．5min，72℃ 1．5min進行28個循環(huán);最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物用1．5% 瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。

3 結果與結論

3．1 細菌的分離、培養(yǎng)特性和生化試驗 全血接種2個胰眎瓊脂斜面培養(yǎng)基后共培養(yǎng)出8個呈乳白色、圓形、凸起的菌落，經(jīng)過細菌的分離、培養(yǎng)特性觀察和生化試驗，對菌體革蘭氏染色后，放在顯微鏡1000倍油鏡下觀察:菌體呈細小球狀，呈紅色(陰性)，菌落經(jīng)結晶紫染色后呈紫色，無 H2S產(chǎn)生，初步診斷分離的該流行菌株為布魯氏菌屬犬種。

3．2 凝集試驗 病犬血清樣品粗糙型布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗結果呈陽性反應(+)，詳見表2;病犬血清樣品粗糙型布魯氏菌病試管凝集試驗結果也呈陽性反應(+)，詳見表3。病犬血清樣品光滑型布魯氏菌凝集試驗均呈陰性反應(－)，本項血清學試驗診斷結果證明了該病犬感染了粗粗糙型布魯氏菌。

表2 粗糙型布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗結果

表3 粗糙型布魯氏菌病試管凝集試驗結果

3．3 AMOS － PCR 鑒定結果 A19、M28、S2 和RM6/66均在劃線接種后72 h均出現(xiàn)可見的小菌落，本研究中的分離菌培養(yǎng)72 h同樣形成肉眼可見的菌落，比其它光滑型布魯氏菌形成的菌落稍大。單個菌落接種TSB液體培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)20 h后，提取基因組DNA。取2μL進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下均能觀察到特異性條帶。PCR產(chǎn)物電泳結果見圖2。該項試驗進一步證明了本次分離的菌株為犬種布魯氏菌。

圖2 AMOS-PCR鑒定結果

通過對該只貴賓犬的病原學診斷，將病犬全血培養(yǎng)收獲的布魯氏菌株命名為Brucella canis GB1。

［1］ 尚德秋．動物布魯氏菌病［M］，北京:科學技術文獻出版社，1992:283－292．

［2］ 吳清民．獸醫(yī)傳染病學［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2002:187－193．

［3］ 劉秉陽．布魯氏菌病學［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社出版，1989:327－373．

［4］ 世界衛(wèi)生組織著，農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局譯．哺乳動物、禽、蜜A類和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊［M］．北京:農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2002:363－388．

［5］ 丁家波，張存帥，彭小兵，等．布魯氏菌種屬鑒定多重PCR方法的建立及初步應用［J］．中國獸醫(yī)學報．2009，29(5):594 －597．

［6］ 彭小兵，程君生，夏業(yè)才，等．多重PCR方法鑒別牛、羊、豬種布魯氏菌株［J］．中國獸藥雜志．2010，44(2):12 －14．