楊 雷，李 偉，漆世華，秦紅剛，韓 興，謝紅玲，溫文生，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病［1］。該病于 1987年最早發(fā)現(xiàn)于美國［2］。1991年，荷蘭中央獸醫(yī)研究所確定該病的病原是一種新的RNA病毒，并命名為Lelystad病毒［3－4］。1996 年郭 寶清 等［5］首 次 從 國 內(nèi)疑 似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。2006年4月［6］我國豬群暴發(fā)了高致病性繁殖與呼吸綜合征，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由高度變異的PRRSV引起的豬的烈性傳染病，是我國新出現(xiàn)的重大動物疫病，已成為當前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。

我國目前控制PRRS的主要方法是使用疫苗進行免疫預防，高滴度的病毒液是疫苗生產(chǎn)中非常重要的一個環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)Marc－145細胞制備PRRS疫苗均采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于存在瓶與瓶之間細胞密度不整齊、勞動強度大、生產(chǎn)成本高，且操作過程易污染等缺點，自2012年2月1日起，農(nóng)業(yè)部已停止受理轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的的獸用細胞苗生產(chǎn)線項目獸藥GMP驗收申請。因此，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶工藝的應用必將越來越受到限制。自20世紀60年代微載體生物反應器培養(yǎng)技術(shù)建立以來，國外許多國家對其在疫苗生產(chǎn)中的應用進行了廣泛研究，細胞懸浮培養(yǎng)已是當前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式［7］。在國內(nèi)利用生物反應器生產(chǎn)口蹄疫病毒，其抗原含量比轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)提高10倍以上，疫苗的不良反應得到進一步改善［8］。利用生物反應器微載體培養(yǎng)Marc－145細胞繁殖PRRSV具有許多優(yōu)點，例如提高生產(chǎn)能力，減少對勞動力的需求，降低污染的風險，同時通過灌注培養(yǎng)不斷更換培養(yǎng)基，提供充足的營養(yǎng)成分且?guī)ё叽x產(chǎn)物，優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境，大大提高了細胞的生長密度，從而可以獲得較大量高滴度的PRRSV。本實驗對生物反應器灌注培養(yǎng)技術(shù)應用于PRRS疫苗生產(chǎn)作了進一步研究，取得了很好的效果。

1 材料與方法

1．1 細胞 病毒培養(yǎng)用Marc－145細胞來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，將該細胞連續(xù)傳30代進行致腫瘤實驗，其結(jié)果為陰性。細胞培養(yǎng)液為含8%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基DMEM(清大天一，批號110405)。

1．2 毒種 生產(chǎn)用毒種為PRRSV PC弱毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和中博生物股份有限公司構(gòu)建的基因工程疫苗株，病毒維持液為含1%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基DMEM。攻毒用毒株為PRRSV GD第5代毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離鑒定并提供。

1．3 微載體 微載體為Cytodex－1(Pharmacia)。Cytodex－1水化處理方法是用無鈣鎂離子的PBS溶液洗滌2次，37℃浸泡2 h，121℃高壓滅菌30 min，置4℃貯存待用，使用前用細胞培養(yǎng)液洗滌2次。

1．4 生物反應器細胞培養(yǎng) 分別用1×104/mL和1×105/mL濃度的Marc－145細胞接種于NBS310型生物反應器中進行微載體培養(yǎng)。培養(yǎng)體積10 L，微載體濃度10 g/L，控制pH在7．2，溫度為37℃，溶解氧(DO)值設為50，攪拌速度為30～50 r/min。培養(yǎng)細胞過程中監(jiān)測葡萄糖含量，每天取樣檢測細胞數(shù)量，根據(jù)葡萄糖的消耗量和細胞生長情況調(diào)節(jié)灌注速度。

1．5 疫苗制備 細胞培養(yǎng)至一定密度后，開始灌注維持液，當灌注2個工作體積后接種病毒，停止灌注，進行病毒吸附，2～3 h后開始灌流收獲病毒液，每天取樣測定病毒滴度。在測定的病毒含量大于106．0TCID50/mL病毒液中加入適量的凍干保護劑，經(jīng)冷凍干燥制備試驗疫苗，進行質(zhì)量檢驗。

1．6 病毒含量測定 將不同時間段收獲的病毒液用無血清DMEM細胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取10－3、10－4、10－5、10－64 個稀釋度，分別接種已長成良好單層、棄去細胞培養(yǎng)液的96孔Marc－145細胞培養(yǎng)板，每個稀釋度接種6孔，每孔0．1 mL，同時設正常細胞對照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，每孔補加含4%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液0．1 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察5 d，根據(jù)Reed－Muench法計算TCID50。

1．7 效力測定 將懸浮培養(yǎng)的3批PRRSPC株病毒液制備成活疫苗，每批分別免疫28日齡PRRS抗原抗體雙陰健康仔豬5頭，免疫劑量1頭份(每頭份病毒含量≥105．0TCID50)，頸部肌肉注射，免疫28 d后連同未免疫對照豬一起，用PRRSV GD第5代毒株105．0TCID50/mL攻毒，頸部肌肉注射3 mL/頭豬，效力檢驗結(jié)果以攻毒后臨床觀察及體溫測定結(jié)果，21 d后剖檢肺部出現(xiàn)的實質(zhì)性病理變化或死亡等指標為發(fā)病判定標準，計算保護率。

2 結(jié)果

2．1 不同細胞接種濃度對細胞培養(yǎng)的影響 分別用1×104/mL和1×105/mL的細胞濃度接種反應器，觀察發(fā)現(xiàn)，在接種6 h后，90%細胞貼附上微載體，并開始伸展;第2天后細胞生長速度增快。隨著細胞增殖速度增加，灌注量也隨之適當增加，在本實驗灌注培養(yǎng)條件下，細胞的形態(tài)一直保持較好。

以1×105/mL細胞濃度接種反應器，培養(yǎng)至第4天細胞密度達6×106～7×106/mL，細胞狀態(tài)穩(wěn)定，維持時間長，利于病毒生產(chǎn);而以接種細胞濃度為1×104/mL接種反應器后，培養(yǎng)至第6天密度才能達到高峰，但仍有部分微載體上未長滿或僅有幾個細胞貼壁，甚至出現(xiàn)空球，由于細胞培養(yǎng)時間過長，不利于病毒生產(chǎn)。細胞增殖曲線見圖1。

圖1 不同細胞接種量的細胞增殖曲線

2．2 病毒感染復數(shù)對毒價的影響 以1×105/mL細胞密度接種反應器，于第4天細胞密度達7×106/mL左右時接種病毒，接種前換用維持液，當灌注2個工作體積后接種病毒。病毒感染復數(shù)分別為0．01和0．001，取樣測定毒價后發(fā)現(xiàn)，毒價高峰出現(xiàn)在第3～4天，以后逐漸下降。兩種感染復數(shù)的毒價差別不顯著，0．01MOI的毒價整體水平略高于0．001MOI，且毒價高峰較早于后者，結(jié)果見圖2。

圖2 不同感染復數(shù)的病毒增殖曲線

2．3 灌流體積 培養(yǎng)細胞過程中每天監(jiān)測培養(yǎng)液中葡萄糖含量及檢測細胞數(shù)量，根據(jù)葡萄糖的消耗量和細胞生長情況調(diào)節(jié)灌注速度，灌注速率為0～3個工作體積/d，接種病毒后，調(diào)節(jié)灌注速度和收獲速度，在整個細胞培養(yǎng)過程中控制葡萄糖含量在5 mmol/L左右。整個培養(yǎng)過程中灌注速度和葡萄糖含量測定結(jié)果見表1。

表1 灌注速度和葡萄糖含量測定結(jié)果

2．4 病毒含量測定 以1×105/mL細胞密度接種反應器，將細胞培養(yǎng)至7×106/mL左右時接種病毒，接種前換用維持液，當灌注2個工作體積后以感染復數(shù)為0．01接種病毒，于感染每12 h為時間段取樣測定收獲病毒的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同時間段收獲的病毒含量測定

從測定的結(jié)果可以看出在感染后36 h內(nèi)收獲的病毒含量低于106．0TCID50/mL，感染后96 h細胞完全病變，停止收獲病毒液。將收獲的病毒含量≥106．0TCID50/mL的病毒液用于配苗。

2．5 疫苗制備及質(zhì)量 以1×105/mL細胞密度接種反應器，將細胞培養(yǎng)至7×106/mL左右時接種病毒，感染復數(shù)為0．01，于感染后36 h開始收獲，至96 h后停止灌流。將收獲的病毒含量大于106．0TCID50/mL病毒液進行凍融后加入凍干保護劑經(jīng)冷凍干燥制成疫苗。將制備的3批疫苗進行無菌、支原體、外源病毒、病毒含量、安全、效力、剩余水分和真空度等檢驗，檢測結(jié)果見表3。疫苗的免疫效力測定結(jié)果見表4。結(jié)果表明，3批疫苗的免疫保護率均為5/5，而對照組5/5發(fā)病，表明按本工藝制備的疫苗其免疫原性沒有發(fā)生變化，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定。

表3 3批豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的質(zhì)量檢驗結(jié)果

表4 3批豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的免疫效力攻毒試驗結(jié)果

3 討論

疫苗開發(fā)是一個不斷創(chuàng)新的過程，目前國內(nèi)獸用疫苗的生產(chǎn)多采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于受到轉(zhuǎn)瓶表面積和培養(yǎng)條件的限制，細胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝在新的疫苗生產(chǎn)中越來越受限。微載體培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)徹底克服了傳統(tǒng)工藝表面積不足的限制，能在有限的空間內(nèi)提供巨大的表面積，實現(xiàn)了培養(yǎng)操作的自動化控制，降低了污染的機會和減少了人力的投入，并且細胞在良好的生理狀態(tài)下生長，可以獲得高密度貼壁細胞，因此具有現(xiàn)代化大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞的顯著優(yōu)勢。

本文研究的PRRS活疫苗生產(chǎn)工藝采用的灌注培養(yǎng)法，營養(yǎng)物質(zhì)不斷補充，代謝產(chǎn)物不斷去除，使細胞處于一種穩(wěn)定的營養(yǎng)狀態(tài)，大大提高了細胞密度。通過調(diào)節(jié)灌注流量，不僅在細胞增殖時穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境，而且在接種病毒后細胞仍能得到足夠的營養(yǎng)和平衡的環(huán)境。本項實驗顯示，在14 L生物反應器中細胞接種量在105/mL左右時，細胞生長4 d后密度可達7×106/mL左右，以0．01MOI感染病毒，接毒 36 h后收獲病毒液，其毒價在 106．0TCID50/mL以上。細胞增殖培養(yǎng)過程中，隨著細胞數(shù)量的增大，灌注速度加快;接種病毒后，由于細胞被感染和部分老化脫落，代謝速度減緩，需逐步降低灌注速度，在整個培養(yǎng)過程中每天調(diào)節(jié)灌注速度使培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度維持在5 mmol/L左右。將收獲的病毒液加入適量的凍干保護劑經(jīng)冷凍干燥制成活疫苗，試制的3批疫苗的病毒含量分別為106．8TCID50/mL、107．0TCID50/mL 和 107．0TCID50/mL，無菌、支原體等項目的檢驗均合格，3批疫苗的免疫保護率均為5/5。研究表明，生物反應器灌注培養(yǎng)Marc－145細胞法可用于PRRS活疫苗的生產(chǎn)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，有較好的應用前景。

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