黃生權，甘海寧，賴煥玲

兒童口服液由枸杞子、茯苓、香菇、山楂、金針菇、紅棗等10余種藥食同源的中草藥配伍，針對少年兒童生長發(fā)育過程中的生理特點，運用現(xiàn)代高新技術精制而成，富含多種氨基酸、維生素及微量元素可提升兒童抵抗力，均衡兒童所需營養(yǎng)，增強兒童體質。本實驗觀察了兒童口服液對小鼠免疫功能的影響，現(xiàn)將實驗結果報道如下。

1 材料

1.1 受試藥物

兒童口服液，由無限極（中國）有限公司提供，批號：12J16A01A-A；茯苓多糖口服液，湖南補天藥業(yè)有限公司，批號：20120602。

1.2 主要試劑、儀器

環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：04120704；DNCB，廣州齊云生物科技有限公司，批號：0168B383；丙酮，天津大茂化學試劑廠，批號：20110414；蓖麻油，天津市耀華化學試劑有限責任公司，20100205；RPMI1640培養(yǎng)液，Thermo，批號：NXJ0699；小牛血清，GIBCO，批號：8122818；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，EL204；恒溫水浴箱，上海精宏實驗設備有限公司，DK-420S；全波長酶標儀，Thermo Fisher Scientif i c Oy，1510。

1.3 動物

KM小鼠，SPF級，合格證號：SCXK（粵）2008-0020，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 對免疫器官重量的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對照組和模型組給予等容積蒸餾水。于實驗前5 d，除正常對照組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。末次給予受試樣品1 h后，脫頸椎處死小鼠，取胸腺和脾臟精密稱重，計算臟器系數(shù)。

2.2 溶血素抗體含量測定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10 g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對照組和模型對照組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，除正?？瞻讓φ战M外均腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。試驗第24 d，各組腹腔注射綿羊紅細胞（0.2 mL/只），免疫6 d后，眼眶取血，分離血清進行溶血素含量的測定。

綿羊紅細胞（SRBC）的制備：兩倍體積液阿氏液（Alsever）與一倍體積綿羊紅細胞混勻，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用時取上述保存的綿羊紅細胞，用生理鹽水洗滌3次，每次2000 rpm，5 min，棄上清液，再用生理鹽水3:5稀釋。

補體制備：取豚鼠8只，心臟采血，離心分離血清，-20℃保存，臨用時生理鹽水1:10稀釋。

溶血素測定：取小鼠血清，用生理鹽水500倍稀釋。各組樣品管中分別加入1:500小鼠血清1 mL、1:10補體血清1 mL、以及稀釋10%SRBC 0.5 mL混勻，另取空白管，分別加入等量的補體、SRBC及1 mL生理鹽水。然后各管于37℃水浴鍋中水浴10 min后，冰浴10 min終止反應，2000 rpm離心10 min，取上清液，以空白管調零，在可見光分光光度計540 nm處測定各管OD值。記錄結果，進行統(tǒng)計學處理。

2.3 對遲發(fā)超敏反應的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d?？瞻讓φ战M和模型組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，每只小鼠腹部去毛，范圍約3 cm×3 cm，將含5%DNCB的丙酮麻油溶液(1:1,V/V)50 μL均勻涂抹致敏，次日強化1次；小鼠致敏后立即腹腔注射環(huán)磷酰胺125 mg.kg-1誘導小鼠降低的DTH反應。致敏5 d后，用5%DNCB丙酮麻油溶液10 μL均勻涂抹于各組小鼠右耳內外兩面進行攻擊，左耳涂抹等量無DNCB的丙酮麻油溶液。攻擊24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，于耳片外側2/3部分用打孔器取下直徑8 mm的耳片，置電子天平稱重，以左右耳片重量之差作為腫脹度。記錄結果并進行統(tǒng)計學處理。

2.4 對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對照組和模型對照組給予等容積蒸餾水。實驗前5 d，除正常對照組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg/日），連續(xù)3 d。末次給予受試樣品1 h后，由小鼠尾靜脈注入50%印度墨汁生理鹽水溶液（0.1 mL/10g），在注入墨汁后30 s及6 min從小鼠眼眶取血，用移液槍取25 μL，立刻吹入2 mL Na2CO3（0.1%）溶液中，于該溶液中吸入、吹出數(shù)次以充分洗出吸管壁附著之血液。再取25 μL空白小鼠血置于2 mL0.1% Na2CO3溶液中作為校準，于可見分光光度計675 nm處測定吸光度。脫頸椎處死小鼠，取肝臟和脾臟精密稱重，按下式計算吞噬指數(shù)K、吞噬系數(shù)（校正吞噬指數(shù)）α。記錄結果，并進行統(tǒng)計學處理。

（式中C為血中碳粒濃度即吸光度；T為時間（min）；W為體重（g）；WLS為肝脾合重（g））

2.5 NK細胞活性測定

灌胃給予受試樣品（0.2 mL/10g），每天1次，連續(xù)30 d。正常對照組給予等容積蒸餾水。末次給予受試樣品1 h后處死動物，取脾進行實驗。①小鼠脾細胞懸液的制備方法同前，細胞濃度為5×106個/mL。②靶細胞：傳代培養(yǎng)的L929細胞在實驗前一天換液，實驗時用0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化1～2 min，加完全1640培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使其完全從壁上脫落，1000 rpm離心5 min，傾去上清液，將沉積細胞重懸于含10%小牛血清1640培養(yǎng)液中，調細胞濃度至1×105個/mL即為備用的靶細胞。③NK細胞活性的測定：向96孔平底塑料培養(yǎng)板每孔中分別加入靶細胞懸液（0.1 ml/孔）,然后放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h，使靶細胞貼壁成一單層細胞，實驗組每孔加入0.1 mL效應細胞(使效靶細胞比例為50:1)，每樣品做3個復孔，靶細胞對照孔加1640培養(yǎng)液0.1 mL，再放置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)20 h，傾去上清液，用生理鹽水輕輕灌滿各孔，以除去效應細胞及被殺傷而脫落下來的靶細胞，重復3次，在濾紙上吸干孔內水分，每孔加入0.1 mL中性紅染液（0.1%），37℃培養(yǎng)30 min，棄去染液，再用生理鹽水洗3次后，每孔加入0.1 mL細胞溶解液（醋酸：乙醇=1:1)，使吞有中性紅的靶細胞溶解，釋放出中性紅，輕輕震蕩使分散搖勻。用酶標儀在492 nm處測定OD值。按照如下公式計算殺傷率即為NK細胞活性。結果進行統(tǒng)計學處理。

2. 6 統(tǒng)計方法

所有實驗數(shù)據(jù)均以x±S表示。計量數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件進行方差分析及組間檢驗。P < 0. 05有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 兒童口服液對小鼠免疫器官重量的影響

表1 兒童口服液對免疫器官重量的影響（x±S）

3.2 兒童口服液對小鼠血清溶血素含量的影響

表2 兒童口服液對溶血素抗體含量的影響（x±S）

3.3 兒童口服液對小鼠遲發(fā)超敏反應的影響

表3 兒童口服液對環(huán)磷酰胺降低小鼠DTH反應的影響（x±S）

3.4 兒童口服液對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

表4 兒童口服液對單核-巨噬細胞功能的影響（x±S）

3.5 兒童口服液對小鼠NK細胞活性的影響

表5 受試品對NK細胞活性的影響（x±S）

4 討論

胸腺和脾臟都是重要的免疫器官，其中胸腺是T細胞分化、成熟的場所，其功能狀態(tài)直接決定機體的細胞免疫水平，并間接影響體液免疫功能。脾臟是免疫細胞定居的場所，也是免疫應答的場所，可以制造免疫球蛋白、補體等免疫物質，發(fā)揮免疫作用[1]。體液免疫是機體特異性免疫的重要組成部分，負責體液免疫的細胞是B細胞。B淋巴細胞在抗原刺激及Th細胞輔助下，最終分化成能產(chǎn)生抗體的漿細胞?？贵w形成細胞數(shù)量的多少可反映機體體液免疫的水平[2]。遲發(fā)型變態(tài)反應是由于機體T2淋巴細胞受抗原刺激后，分化為特異性的致敏T2淋巴細胞，當致敏T2淋巴細胞再次接觸相同的抗原后，引起遲發(fā)型超敏反應，使T2淋巴細胞活化，釋放出多種淋巴因子，產(chǎn)生炎癥，炎癥反應的程度反映了機體對該抗原特異性細胞免疫力的大小[3]。單核巨噬細胞系統(tǒng)在機體的特異性和非特異性免疫中亦發(fā)揮重要作用，如直接吞噬、殺傷病原體和腫瘤細胞，產(chǎn)生免疫調節(jié)因子等，顯示出非特異性免疫作用[4]。NK細胞是一類重要的免疫調節(jié)細胞，是機體細胞免疫功能的組成部分，NK細胞能非特異性地殺傷靶細胞（主要是某些腫瘤細胞和病毒感染細胞），因此，NK細胞在腫瘤免疫、抗病毒感染中具有重要作用，已公認其在免疫監(jiān)視中為最重要的效應細胞[5]。

本實驗的結果表明，兒童口服液可顯著升高免疫功能低下小鼠的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù), 增加血清中溶血素抗體的含量，提高免疫抑制小鼠遲發(fā)超敏反應強度，增加單核-巨噬細胞的吞噬能力，提高小鼠NK細胞的活性，提示兒童口服液能夠提高機體免疫功能。

[1] 沈關心.微生物與免疫學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:17.

[2] 李儀奎. 中藥藥理實驗方法學(第二版)[M].上海:上?？茖W技術出版社,2006:159.

[3] 徐叔云.藥理試驗方法學(第三版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:1420.

[4] 劉藝萍.巨噬細胞的抗腫瘤效應[J].國外醫(yī)學?免疫學分冊,1998, 21(4): 207.

[5] 王蒙.自然殺傷細胞的抗病毒活性[J].免疫學雜志, 2003,19(2):154.